Die Kombination Peripheral Nerve Grafting und Matrix Modulation der Verletzte Rat Spinal Cord Repair

Die Vorbereitung für die Transplantation eines peripheren Nervs an eine verletzte Stelle des Rückenmarks beginnt mit der prädegenerativen Behandlung des PNG sieben bis zehn Tage vor der Transplantation. Der tibiale Nervenzweig einer Spenderratte wird durchtrennt. Ein halbseitiger Schnitt auf zervikaler Ebene fünf oder C5 wird durch Absaugung vorgenommen.

Das PNG wird aus der Spenderratte entfernt und an der rostralen Wand der Läsionshöhle angelegt und durch Vernähen mit Aurum an der Dura mater fixiert. Drei Wochen später wird eine dorsale Quadrantläsion im Bereich C7 erzeugt, und Gelatineschwamm, der mit C-H-A-B-C gesättigt ist, wird 15 Minuten lang in die Höhle eingebracht, um die Proteoglykane der gliösen Narbe abzubauen. Zwei Tage später wird C-H-A-B-C mikroinjiziert, und zwar in der Nähe der Läsionsstelle, und das distale Ende des PNG wird an der dorsalen Quadrantläsion angelegt.

Hallo, ich bin John Hula. Ich bin der Leiter des Forschungszentrums für Rückenmarkverletzungen am College of Medicine der Drexel University. Ich bin Dr. Veronica Tom aus dem Hula-Labor und ich bin Martha Mean.

Aus dem Hula-Labor. Heute werden wir ein Verfahren zur Transplantation eines peripheren Nervensegments in das verletzte Rückenmark einer erwachsenen Ratte demonstrieren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Regeneration von Axonen und die Wiederherstellung der Funktion nach einer Rückenmarksverletzung zu untersuchen.

Beginnen wir. Zur Vorbereitung auf den mikroskopischen Eingriff desinfizieren Sie die Operationsstation und autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Bereiten Sie die Wärmeabschirmung sowie die kleinen, weniger als zwei Kubikmillimeter großen Stücke aus Gelatineschwamm für die mikrochirurgische Blutstillung vor.

Legen Sie Wattestäbchen, Gazetupfer und chirurgische Instrumente bereit. Platzieren Sie die anästhetisierte Ratte auf dem Präparationstisch, nachdem Sie mittels Zehenquetschung bestätigt haben, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Rasieren Sie einen großen Bereich des Fells im vorgesehenen Operationsfeld ab und waschen Sie die Operationsstelle gemäß der im begleitenden Textprotokoll beschriebenen aseptischen Desinfektionstechnik.

Stellen Sie danach die Ratte auf die Wärmesperre, bedecken Sie Nase und Mund mit der Inhalationshaube und reduzieren Sie das Isofluran auf 3 % und die Flussrate auf 0,2 Liter pro Minute. Verabreichen Sie die geeignete Dosis des Antibiotikums Ampicillin subkutan und des Analgetikums Buprenorphin intramuskulär. Der periphere Nerv oder PN wird sieben bis zehn Tage vor seiner Entnahme durchtrennt, um die Degeneration zu fördern, was eine Umgebung schafft, die für das axonale Wachstum besser geeignet ist als eine frische Nervpräparation.

Um die Durchtrennung des Nervus ischiadicus (pn) zu beginnen, legen Sie das Tier auf die Seite. Wechseln Sie zu sterilen Handschuhen und platzieren Sie ein steriles chirurgisches Tuch um die Operationsstelle. Führen Sie einen geraden Schnitt von der Hüftkopfregion bis zum Knie durch, wobei der Schnitt parallel zum Femur verläuft und etwa drei Millimeter seitlich davon entfernt liegt. Durchtrennen Sie die oberflächlichen Muskeln des Musculus biceps femoris entlang derselben Linie wie der Hautschnitt, um den darunterliegenden Musculus vastus lateralis freizulegen.

Nachdem der Musculus vastus lateralis freigelegt ist, verwenden Sie eine Schere, um nahe dem Knie einen kleinen Schnitt darin anzulegen, und verlängern Sie diesen in Richtung des Femurkopfs. Trennen Sie vorsichtig mit Retraktoren den Musculus vastus lateralis, bis die gemeinsamen Nervenäste des Nervus tibialis und des perinealen Nervs des Ischiasnervs sichtbar werden, die parallel zum Femur verlaufen. Verfolgen Sie anschließend diese Nervenäste in Richtung des Femurkopfs, bis der Hauptstamm des Ischiasnervs identifiziert ist.

Knapp unterhalb der Bifurkation des Nervus ischiadicus verwenden Sie feine Pinzette, um das umgebende Bindegewebe oder Epineurium des Nervus tibialis vorsichtig zu lösen. Dieser ist der größere Ast. Sobald der Nervus tibialis isoliert ist, führen Sie eine Seidenligatur (6-0) darum und ziehen sie fest.

Verwenden Sie eine Mikroschere, um den Nerven quer zur Ligatur zu durchtrennen. Führen Sie den Faden durch den Musculus vastus lateralis und verknoten Sie ihn. Dieser Faden dient als Markierungslinie zur einfachen Lokalisation des durchtrennten Endes des Nervus tibialis.

Wenn der Nerv entnommen ist. Danach schließen Sie den Musculus vastus lateralis mit sechs Seiden-Nähten. Anschließend schließen Sie den Musculus biceps PMOs mit sechs Seiden-Nähten.

Schließen Sie die Haut abschließend mit Michelle-Wundclips. Schalten Sie den Fluss von Isofluran aus und entfernen Sie die Inhalationsmaske. Stellen Sie das Tier in einen Aufbewahrungsbehälter auf eine thermische Unterlage.

Bringen Sie das Tier in seinen Heimkäfig zurück. Sobald es sieben bis zehn Tage später wach und aktiv ist, kann das PN-Segment entnommen werden. Um mit der Transplantation zu beginnen, stellen Sie das anästhetisierte Tier auf die thermische Barriere.

Nachdem bestätigt wurde, dass das Tier vollständig anästhesiert ist, entfernen Sie die Wundklammern und öffnen Sie den Hautschnitt. Eine Rasur der Region ist möglicherweise nicht erforderlich, da die Haut leicht auseinandergezogen werden kann, wodurch Kontamination vermieden wird. Indem der Schnitt durch Fell entfällt, schneiden Sie durch die Naht des oberflächlichen Muskels, um den Musculus vastus lateralis freizulegen, und führen Sie einen Schnitt durch die Naht in diesem Muskel.

Verfolgen Sie die Nahtlinie bis zum Schnittende des Nervus tibialis und entfernen Sie die Naht vom Nerv. Lösen Sie mit feiner Pinzette das Epineurium von einer 15 Millimeter langen Strecke des Nervus tibialis und durchtrennen Sie dieses distale Ende. Entnehmen Sie das Nervensegment und legen Sie es in sterile Hank'sche Pufferlösung (Hank's balanced salt solution).

Wir sind nun bereit für den nächsten Schritt, bei dem eine Querschnittsläsion für die Transplantation des PN induziert wird, die autolog oder heterolog sein kann. Legen Sie die anästhetisierte Ratte auf die Wärmeunterlage und verabreichen Sie Antibiotika und Analgetika wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, um eine HEMI-Querschnittsläsion des Rückenmarks zu induzieren. Lokalisieren Sie zunächst die Hinterhauptscharte und den hervorstehenden dorsalen Dornfortsatz von T zwei.

Führen Sie einen Schnitt über die gesamte Länge zwischen diesen äußeren Orientierungspunkten durch. Schneiden Sie entlang der Mittellinie des oberflächlichen Musculus trapezius und trennen Sie die darunterliegenden Halsmuskeln der Ardis-Muskulatur. Führen Sie einen Halsretractor ein, um die Muskeln auseinanderzuhalten.

Die tiefen oberhalb des Rückenmarks liegenden Muskeln sollten von den dorsalen Wirbelkörpern von C vier, C fünf und C sechs abgetrennt werden. Führen Sie unter Verwendung von R-Jurors eine partielle Laminektomie von C fünf durch, um die gesamte rechte Seite und den medialen Teil der linken Seite des Rückenmarks freizulegen. Verwenden Sie die hervorstechende dorsale Vene als Orientierungspunkt für die Mittellinie des Rückenmarks.

Verwenden Sie anschließend eine mikrochirurgische Skalpellklinge, um die Dura mater zu durchstechen, und verlängern Sie den Schnitt über das C5-Rückenmark. Führen Sie mit einer gezogenen Glas-Mikrokanüle einen kleinen Schnitt in die darunterliegende Subarachnoidal- und Pia-mater ein. Beginnen Sie, die dorsale rechte Seite des Rückenmarks unter leichtem Unterdruck und mit Hilfe von Mikrozangen vorsichtig zu aspirationsentfernen, um das Gewebe zu lösen und seine Entfernung zu erleichtern.

Fahren Sie durch die intermediären und ventralen Anteile des Rückenmarks fort, um einen zwei Millimeter langen Hohlraum zu schaffen, der vollständig von dorsal nach ventral und von der Mittellinie bis zu den lateralen Hirnhäuten reicht. Platzieren Sie mit Salzlösung getränkten Gelatineschwamm in die Läsionshöhle des HEMI-Abschnitts. Um die Blutstillung zu erreichen, entfernen Sie das zuvor entnommene Segment des peripheren Nervs aus der Hank-Lösung.

Fühlen Sie vorsichtig das Epimysium aus den proximalen drei Millimetern des Nervensegments und führen Sie dieses Ende der rostralen Wand der Läsionshöhle des HEMI-Abschnitts zu. Sichern Sie das Segment mit 10-0-Nähten durch das Epimysium zum Dura mater. Nähen Sie anschließend die Dura über dem implantierten Ende des Transplantats zu, indem Sie das Transplantat zwischen zwei Stücke einer elastischen Zellmembran einklemmen.

Platzieren Sie die Transplantat neben den C6-, C7- und T1-Wirbelkörpern. Bringen Sie das distale Nervenende nicht mit dem Rückenmark oder Muskelgewebe in Kontakt. Verschließen Sie die Muskelschichten lagengerecht mit 4-0-Nähten und die Hautinzision mit Wundclips.

Schließlich das Tier in einen Haltebehälter auf einer Wärmesperre platzieren und in seinen Heimkäfig zurückbringen. Sobald es wach und aktiv ist, scheitern regenerierte Axone, die das distale Ende des PN-Transplantats erreichen, häufig daran, erneut in das Rückenmark einzudringen. Daher verwenden wir Mikroinjektionen von Chondroitin-ACE, um das Narbengewebe um den Verletzungsbereich abzubauen.

Dieses Verfahren wird 21 Tage nach der PN-Transplantation durchgeführt, um zu beginnen, und es ist zu bestätigen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Anschließend sind die Wundclips zu entfernen und Antibiotika sowie Analgetika wie zuvor gezeigt zu verabreichen. Mit feinen Pinzetten und Feder-Scheren sind die oberflächlichen Nähte zu durchtrennen, um die elastische Membran freizulegen, die das Nervenimplantat umgibt.

Lösen Sie vorsichtig die Nervenlänge von den elastischen Zellmembranen. Heben Sie den Nerv aus dem Operationsfeld ab. Führen Sie eine partielle Laminektomie an der rechten Seite des C7-Wirbelkörpers durch.

Stechen Sie mit einer mikrochirurgischen Skalpellklinge in die Hirnhäute und bereiten Sie durch Aspiration einen einkubikmillimetergroßen dorsalen Quadrantdefekt im C7-Rückenmark vor. Legen Sie mit Kochsalzlösung getränkten Gelatineschwamm in den Defekt, um die Hämostase zu erreichen. Danach ersetzen Sie den Schwamm durch einen, der mit Chondroitin-Nase getränkt ist.

A BC. Behandeln Sie die Läsionsstelle 15 Minuten lang, wobei alle fünf Minuten frisches, mit Chondroitin getränktes Gel-Schaummaterial bereitgestellt wird. Bedecken Sie die äußere Länge des Nerventransplantats mit einer scholastischen Membran. Nähen Sie die oberflächlichen Muskeln mit vier Oh-Nähten und verschließen Sie den Hautschnitt mit Wundclips.

Stellen Sie das Tier in einen Haltekafig auf eine thermische Unterlage und bringen Sie es zurück in seinen Heimkafig, sobald es wach und aktiv ist. Zwei Tage später, 23 Tage nach der PN-Transplantation, wird erneut eine Operation am Tier durchgeführt, um Chondroitin-NA in das Rückenmark einzuspritzen. Wie zuvor werden die Wundklammern vom anesthetisierten Tier entfernt, und Antibiotika sowie Analgetika werden verabreicht.

Schneiden Sie durch die oberflächlichen Nähte, um die elastische Membran freizulegen, die das Nervenimplantat umgibt. Legen Sie die Implantationsstelle des C7-Nervs frei, ohne das Implantat zu beeinträchtigen. Anschließend injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze und einer gezogenen Glas-Kapillare einen Mikroliter Chondroitinsulfatase ABC in die rechte Seite des Rückenmarks, etwa einen Millimeter distal zur Stelle, an der das Implantat an das Rückenmark angrenzt.

Lösen Sie vorsichtig die EUR aus den distalen zwei Millimetern des Nervensegments und führen Sie dieses Ende der Läsionshöhle im C7-Bereich zu. Befestigen Sie das Segment mit 10-0-Nähten durch das Epineurium an der Dura mater. Schließen Sie die oberflächlichen Muskeln mit vier 0-Nähten und den Hautschnitt mit Wundclips.

Stellen Sie das Tier in einen Haltebehälter auf einer Wärmesperre und bringen Sie es zurück in seinen Heimkäfig, sobald es wach und aktiv ist. Wenn dieses Verfahren optimiert ist, wird das periphere Nervensegment eng mit dem Wirts-Rückenmark integriert, um spinale Axone sichtbar zu machen, die in das Transplantat regenerieren. Wir füllten das Transplantat durch Diffusion mit biotinyliertem Dextrinamin oder BDA aufsteigend und absteigend.

Spinale Axone betreten das Transplantat in der Regel und wachsen in einer relativ geraden Linie parallel zur Länge des Transplantats, wobei sie sich mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Millimeter pro Tag bis zum distalen Ende des Transplantats erstrecken. Periphere Nervenaxone dringen in das angrenzende Rückenmark ein. Wenn Chondroitin-NACE verwendet wurde, um hemmende Proteoglykane aus dem umgebenden Narbengewebe zu entfernen, nachdem das distale Ende erreicht wurde, erstrecken sich nach Behandlung mit dem Fahrzeugmittel nur sehr wenige periphere Nervenaxone in das Wirtsgewebe.

Jedoch wenn die distale Grenzfläche mit Chondroitin behandelt wurde, treten signifikant mehr Axone aus dem Transplantat aus, um das Rückenmark wieder zu innervieren. Wie hier in diesem einen repräsentativen Schnittabschnitt von 15 bis 20 Abschnitten pro Tier gezeigt, in denen axonales Wachstum beobachtet wird, demonstriert dieses Balkendiagramm eine signifikante Zunahme des axonalen Wachstums nach Behandlung mit Conjoin Nace A BC. Die immunchemische Nachweisung synaptischer Marker an Rückenmarkneuronen als Reaktion auf elektrische Stimulation der Axone innerhalb des Transplantats kann verwendet werden, um die funktionelle Konnektivität zwischen transplantiertem Gewebe und Wirts-Rückenmark zu bewerten.

Dieser Rückenmarkabschnitt, der die distale Appositionsregion enthält, wurde immunzytochemisch sowohl für biotinyliertes Dextrinamin in Grün als auch für das synaptische Markermolekül Synapsin in Rot gefärbt. Pfeilspitzen zeigen Bereiche mit Kolokalisation der Marker an, was darauf hinweist, dass einige aus dem Transplantat regenerierte Fasern funktionelle synaptische Kontakte ausbildeten. Die funktionelle Verbindung zwischen Neuronen des Transplantats und des Rückenmarks wurde außerdem durch Nachweis der CFOs-Expression belegt. Nach synaptischer Stimulation von Wirtneuronen jenseits der distalen Grenzfläche kann dieser transsynaptische Aktivierungsmarker in vielen CFOs-positiven Neuronen im Gewebe ipsilateral zur Transplantationsstelle nachgewiesen werden; bei höherer Vergrößerung sind im Gewebe kontralateral zum Transplantat nur sehr wenige CFOs-positive Neuronen zu beobachten.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Verletzungsstelle des Rückenmarks vorbereitet, um danach eine periphere Nerventransplantation durchzuführen, die die Regeneration nach einer Rückenmarksverletzung fördern soll. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, vor der Transplantation über eine ausreichende Nervenlänge zu verfügen und sicherzustellen, dass das Transplantat eng an der Verletzungsstelle des Rückenmarks anliegt. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.