Name: Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Lernen Sie den EpiDerm Skin Irritation Test zur Bewertung chemischer Hautreizung mit rekonstruierter humaner Epidermis. Diese validierte Methode ersetzt Tierversuche und ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für Kosmetik und Pharmazeutika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren danken an der BfR (Deutschland), BASF SE (Deutschland), IIVS Inc. (USA), zet-LSL (Österreich) ZEBET für die Teilnahme an Multi-center internationalen Validierungsstudie der Modified EpiDerm SIT (5 ).

I. Tissue Klimaanlage - Tag 0 <ol><li> Nach Erhalt der EpiDerm EPI-200-SIT-Kit, überprüfen Sie alle Komponenten des Kits für Integrität (für Kit Details siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte). </li><li> Für alle drei EpiDerm Gewebe, bereiten ein steriles 6-well-Platte mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, öffnen Sie den Plastikbeutel mit dem 24-Well-Platte mit den EpiDerm Gewebe und entfernen Sie die sterile Gaze. </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette zu jeder Einsatz mit den EpiDerm Gewebe zu entfernen und den Einsatz in den leeren 24-Well-Platte. In diesem Schritt entfernen Sie alle verbleibenden Versand Agarose, dass an den Außenseiten des Einsatzes haftet durch sanfte Blotting auf sterilem Filterpapier. </li><li> Innerhalb der nächsten 5 Minuten, visuell den Geweben. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind. </li><li> Mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen sorgfältig trocknen die Oberfläche des Gewebes. Versuchen Sie nicht, das Gewebe direkt berühren - Kapillare Effekte sind ausreichend, um die Feuchtigkeit aus dem Gewebe Oberfläche zu entfernen. </li><li> Nach dem Trocknen der Gewebeoberfläche, Transfer drei Gewebe der oberen Reihe der 6-well-Platten mit 0,9 ml Assay-Medium vorgefüllt. Veröffentlichung Luftblasen unter der Einsätze gefangen. </li><li> Legen Sie die 6-well-Platten, die die Einsätze in den Inkubator für 60 ± 5 min Vorinkubation bei 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH (relative Luftfeuchtigkeit). </li><li> Am Ende der 60 ± 5 min Vorinkubation Zeitraum speichern, übertragen die Einsätze aus dem oberen Brunnen in den unteren Vertiefungen der 6-Well-Platte. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für eine Übernachtung Vorinkubation (18 ± 3 h). </li><li> Platzieren Sie den Rest der Assay-Medium in den Kühlschrank (5 ± 3 ° C). Nach der Übernachtung Vorinkubation, kann der Test Chemikalien für die EpiDerm Gewebe aufgetragen werden. Hinweis: Die Vorinkubation Verfahren kann im Falle einer verspäteten Lieferung Gewebe verkürzt werden (zB wenn Gewebe am Mittwoch anreisen, statt Dienstag). </li></ol> II. Chemische Beanspruchung - Tag 1 <ol><li> Bereiten Sie ein 6-Well-Platte je Testchemikalie, indem die obere Reihe nur mit 0,9 ml pro Vertiefung der Assay-Medium. </li><li> Etwa 5 Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber chemischen Stoffen, entfernen Sie die 6-well Platten mit den vorkonditioniert Gewebe aus dem Inkubator. </li><li> Beurteilen Sie die Oberfläche von Geweben und entfernen Sie alle Feuchtigkeit mit sterilem Baumwolle Tipps. </li><li> Kennzeichnen Sie alle 6-Well-Platte Deckel mit dem Testmaterial Codes oder Namen. </li><li> Dosieren Sie das Gewebe mit dem Test-Chemikalien in Intervallen von 1 Minute zu erleichtern Spülen der Testsubstanzen nach der Exposition. Halten Sie die Platten mit dosierten Gewebe in die sterile Haube, bis der letzte Gewebe dosiert wird. </li><li> Um zu testen, flüssige Chemikalien, verzichten 30 ul der Lösung direkt oben auf das Gewebe und setzen Sie die Nylon-Mesh-Gewebe auf der Oberfläche. Wenn nötig, vorsichtig Position des Netzes mit der Glühbirne geleitet Glas Pasteur Pipette. Drücken Sie nicht auf der Gewebeoberfläche. </li><li> Für die Prüfung semisolids, verwenden Sie eine positive Verschiebung Pipette auf 30 ul direkt oben auf das Gewebe zu verzichten. Bei Bedarf verteilt die Chemikalie mit Pasteurpipette zur Deckung der Gewebeoberfläche so viel wie möglich. </li><li> Für feste Materialien, kurz vor der Applikation der Testsubstanz, befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 &amp;mgr; l sterilem DPBS. Dies verbessert die Berührung der Gewebeoberfläche mit der Testchemikalie. Füllen Sie eine 25 mg kalibriert scharfe Anwendung Löffel (oder einem anderen geeigneten Werkzeug) mit ca. 25 mg fein gemahlenes Probenmaterial. Übernehmen Sie die feste Testchemikalie auf der Gewebeoberfläche. Falls erforderlich, eine Glühbirne geleitet Pasteur Pipette, um den Löffel komplett leer. Schütteln Sie die Einsätze, um die Ausbreitung der Feststoff auf der Oberfläche zu verbessern. </li><li> Für Testsubstanzen mit wachsartiger Konsistenz, versuchen Sie, eine flache "Cookie wie" Stück ca. 8 mm Durchmesser in Form und legen Sie es oben auf das Gewebe, die zuvor mit sterilem DPBS benetzt. Zur Verbesserung des Kontaktes zwischen Prüfsubstanz und Gewebe, wiegen Sie die "Cookie" mit einer Edelstahl oder Kunststoff zu helfen. </li><li> Bewerben DPBS als negative Kontrolle und 5% SDS als positive Kontrolle, die Kontrolle Gewebe. </li><li> Nach der Dosierung der letzten Gewebe, übertragen alle Platten für 35 ± 1 Minuten, um die befeuchteten Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). </li><li> Nach dem 35 ± 1 Minuten Inkubation bei 37 ° C entfernen Sie alle Platten aus dem Inkubator. Legen Sie die Platten in die sterile Haube und warten, bis ein Zeitraum von 60 Minuten Exposition gegenüber chemischen Stoffen zum ersten dosiert Gewebe abgeschlossen ist. </li><li> Anschließend starten Sie den Waschvorgang mit der ein Einsatz pro Minute Zeitintervall (zum Versichee, dass die gesamte Belichtungszeit für jeden Einsatz 60 Minuten). </li><li> Verwenden Sie eine Waschflasche, um das Gewebe mit einer sterilen DPBS spülen. Füllen Sie das Gewebe einfügen 15 Mal mit einem konstanten Strom von DPBS und leeren Sie ihn. (Hinweis: für Gewebe mit einer Nylon-Mesh, waschen Sie die Gewebeoberfläche 5 Mal und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen, scharfen Zangen Danach die restlichen weiter 10 Wäschen). </li><li> Nach dem 15. Spülen mit der Waschflasche, komplett versenken den Einsatz 3-mal in 150 ml DPBS und schütteln, um den Rest des Tests Material zu entfernen. </li><li> Schließlich spülen die Gewebe einfügen einmal von innen und einmal von außen mit einer sterilen DPBS. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges von DPBS aus dem Gewebe durch leichtes Schütteln des Einsatzes und Blotting auf die sterile Löschpapier. </li><li> Übertragen Sie die ausgelöscht Gewebe fügt dem neuen 6-Well-Platte zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt. Alle diese Schritte (14-18) muss innerhalb von 1 min für jeden Einsatz durchgeführt werden. </li><li> Nach dem letzten Gewebe gespült, sorgfältig trocknen die Oberfläche jedes Gewebe mit einem sterilen Wattestäbchen Wattestäbchen. </li><li> Inkubieren des Gewebes in den Inkubator für die nächsten 24 ± 2 Stunden (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). Hinweis: Jeder Test Techniker sollte nicht testen mehr als 6 Testsubstanzen einschließlich der negativen und positiven Kontrollen in einem einzigen Testlauf (set), in der Lage sein zu folgen das Protokoll, wie unten beschrieben </li></ol> III. Medium Austausch - Tag 2 <ol><li> Nach dem 24 ± 2 Stunden nach der Inkubation, übertragen Sie die Einsätze in den unteren Teil der 6-Well-Platte mit 0,9 ml Medium vorgefüllt. Medien aus dem oberen Zeilen können für die Analyse der zusätzlichen Endpunkten (Zytokine, Chemokine etc.) gesammelt werden. Die Analyse der sekundären Endpunkte ist optional. </li><li> Fahren Sie mit dem Post-Inkubation (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) für weitere 18 ± 3 Stunden. </li></ol> IV. MTT Viability Assay - Tag 3 <ol><li> Label zwei 24-Well-Platten mit dem chemischen Namen oder Codes. Eine Platte wird für die Gewebe-Inkubation mit MTT dienen und die andere für die Extraktion. </li><li> Bereiten Sie die MTT-Lösung durch Auftauen des MTT-Konzentrat (5 mg / ml) und Verdünnung mit dem MTT Verdünnungsmittel. Endkonzentration von MTT-Lösung ist 1 mg / ml. </li><li> Pipette 300 ul MTT-Lösung in jedes Well der 24 Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie die 6-well Platten aus Inkubator, trocknen Sie die Unterseite der Einlagen auf einem Löschpapier, und übertragen sie in die 24-Well-Platte vorgefüllt mit MTT. </li><li> Platzieren Sie den 24-Well-Platte in den Inkubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH) und Inkubation für 3 Stunden ± 5 min. Strikt an die 3 Stunden halten ± 5 min Inkubationszeit auf Abweichung zwischen verschiedenen MTT Lesungen zu vermeiden. </li><li> Wenn die MTT Inkubation abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Saugpumpe vorsichtig absaugen MTT-Medium in allen Bohrungen. </li><li> Füllen Sie den Brunnen mit DPBS und wieder absaugen. Dieser Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe trocken sind nach der letzten Aspiration. </li><li> Nach dem Waschen Transfer der Einsätze, um eine neue 24-Well-Platte. Tauchen Sie die Einsätze durch vorsichtiges Pipettieren 2 mL Extraktionsmittel-Lösung (Isopropanol) in jedes einzufügen. Der Pegel wird über den oberen Kanten des Einsatzes steigen, damit Notlaufeigenschaften Gewebe. </li><li> Seal der 24-Well-Platte (zB mit Parafilm oder mit Dichtkissen) zu Extraktionsmittel Verdunstung zu hemmen. Entpacken Sie die MTT aus dem Gewebe, das für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler (ca. 120 rpm). Übernachtung Extraktion ohne Schütteln kann auch verwendet werden. </li><li> Nach der Extraktion Zeitraum abgeschlossen ist, dringen die Einsätze mit einer Injektionsnadel oder Birne Perlen Pasteurpipette und lassen Sie den Auszug in die Brunnen, aus dem das Insert getroffen wird. </li><li> Entsorgen Sie die punktierten einfügen und Pipette die Lösung in der auch oben und unten drei Mal, bis sie homogen ist. </li><li> Für jedes Gewebe, übertragen zwei 200 ul Aliquots der violetten Formazan-Lösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie die Duplikate nach der festen Platte Design in der Tabelle zu dieser Video-Protokoll gegeben. Für Rohlinge verwenden Isopropanol. </li><li> Lesen Sie die optische Dichte (OD) des MTT-Extrakte in einem 96-Well-Platte Spektralphotometer mit einer Wellenlänge von 570 nm (540-580), ohne eine Referenz zu filtern. </li><li> Geben Sie die Ergebnisse in die Tabelle für die automatische Berechnung der Ergebnisse (Abb. 1). </li><li> Ein Testchemikalie "reizend" (R38 oder GHS Kategorie 2) gekennzeichnet werden, wenn die prozentuale Lebensfähigkeit des Gewebes durch MTT-Assay bestimmt ist &lt;50% bezogen auf das negative Kontrolle. Hinweis: MTT ist giftig, so achten Sie darauf, Schutzhandschuhe zu tragen beim Umgang. Schützen MTT und seine sosungen aus Licht, da MTT ist lichtempfindlich. Verwenden MTT-Lösung innerhalb weniger Stunden nach der Zubereitung, weil es im Laufe der Zeit verschlechtert. </li></ol> V. Assay Qualitätskontrollen <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT-Kit Annahmebedingungen: In-vitro-RHE-Modellen sollten einheitliche, qualitativ hochwertige Daten über die Zeit geben, nicht nur bei der Validierung (8). Empfohlene Richtlinien zur langfristigen Assay-Reproduzierbarkeit und Leistung zu gewährleisten sind "vollständige Charakterisierung von Zellen oder Geweben, Probenahme jeder Partie ... für Leistung und regelmäßigen Gebrauch von Kontrollen und Benchmark Chemikalien, um Gewissheit über die Konsistenz der Assay-Leistung bieten" (9) . Neben Assay Akzeptanzkriterien unten dargelegt, ist jede Produktion viel EpiDerm Qualitätskontrolle durch den Hersteller gegen eine zusätzliche Benchmark chemische getestet (1% Triton X-100). Die Belichtungszeit benötigt, um Gewebeviabilität zu 50% (ET-50) für Triton X-100 ist bestimmt zu reduzieren. Für EpiDerm haben Jahresdurchschnitt ET-50-Werte von 5,9 Stunden auf 7,5 Stunden lag. Die Charge zu Charge CV für negative Kontrolle Gewebe (dh die Variabilität in Baseline Lebensfähigkeit) hat unter 7,5% für jedes Jahr seit 1996 gemittelt. Um die ET50 Wert jeder Produktionscharge müssen innerhalb von 2 Standardabweichungen von dem historischen Durchschnitt Triton X-100 ET50 in 1996 (;; geringere Akzeptanz limit = 4.8h oberen Akzeptanz limit = 8.7h dh ET-50 = 6,7 Stunden) gegründet fallen für die Verwendung durch den Hersteller freigegeben werden. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 1: Negative Kontrolle: Die absolute OD der negativen Kontrolle (NC) Gewebe (Behandlung mit sterilen DPBS) im MTT-Test ist ein Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes im Prüflabor nach Transport und die Lagerung Verfahren und unter bestimmten Bedingungen für die Verwendung erhalten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere OD 570 von der NC Gewebe ist ≥ 1,0 und ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 2: Positive Control A 5% SDS (in H 2 O)-Lösung wird als positive Kontrolle (PC) verwendet werden und gleichzeitig mit dem getesteten Chemikalien getestet. Concurrent bedeutet, dass der PC in jedem Assay getestet werden, aber nicht mehr als ein PC pro Testtag erforderlich ist. Die Lebensfähigkeit der positiven Kontrolle sollte innerhalb von 95% Konfidenzintervall der historischen Daten. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die mittlere Lebensfähigkeit der PC Geweben exprimiert in% der negativen Kontrolle Gewebe beträgt 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay Akzeptanzkriterium 3: Standardabweichung (SD) Die Hautreizung wird aus der mittleren Tragfähigkeit auf 3 Einzel-Geweben bestimmt vorhergesagt und somit die Variabilität der Gewebe repliziert werden sollte akzeptabel niedrig. Der Test erfüllt die Akzeptanz Kriterium, wenn die SD von einzelnen% Gewebe Bewohnbarkeit der 3 gleich behandelt berechnet repliziert ist &lt;18%. </li></ul> Repräsentative Ergebnisse <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Abbildung 2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Abbildung 3"> </div> Abbildung 1 Ergebnisse für 6 Test Artikel, NC und PC-Steuerung erhalten -. Ein Teil der automatisierten Tabellenkalkulation für die Berechnung der Ergebnisse. Testen Sie Chemikalien, die Lebensfähigkeit des Gewebes unter 50% bezogen auf NC reduziert werden als reizend eingestuft. Der Test ist optimiert, um Ergebnisse, die weit genug von der Einstufung cut-off (50% Rentabilität) erhöht so die Stabilität des Assays bieten. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materialien </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Material-Liste">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren sind Angestellte der MatTek Corporation, die Reagenzien und Werkzeuge herstellt, die in diesem Artikel verwendet werden.

In diesem Video haben wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert für die in vitro Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe nachgewiesen. Bei der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, in aseptischen Bedingungen zu arbeiten und sich streng an den validierten Protokoll, da Abweichung vom Protokoll unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Einige Modifikationen des Tests sind möglich, jedoch sollten Änderungen an dem Protokoll direkt mit den Autoren diskutiert werden. Die einzige Einschränkung dieser Methode ist, eine mögliche Störung der Testsubstanz mit dem MTT-Endpunkt. Eine farbige Prüfsubstanz oder eine, die direkt reduziert MTT (und damit imitiert Dehydrogenase-Aktivität der Mitochondrien) können mit dem MTT Endpunkt stören. Allerdings sind diese Testsubstanz nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Test (dh 42 Stunden nach der Testsubstanz Exposition) ausreichende Mengen der Testsubstanz sind immer noch auf den heutigen (oder in) der Gewebe. Bei dieser unwahrscheinlichen Fall, die (wahre) metabolische MTT-Reduktion und der Beitrag durch eine farbige Testmaterial oder (false) direkten MTT-Reduktion durch das Testmaterial kann durch ein Verfahren im Detail in dem Test Standard Operation Procedure bereitgestellt durch beschrieben quantifiziert werden MatTek Corp

ein in vitro skin irritation test (sit) mit dem epiderm rekonstruierte human epidermal (rhe) model

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

Die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) wurde entwickelt,<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Und validiert<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe. Die EpiDerm SIT nutzt die 3D-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Rekonstruierten humanen epidermalen (RHE) Modell EpiDerm. Das Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen ermöglicht Diskriminierung zwischen Reizstoffe der Kategorie 2 des GHS-und Nicht-Reizstoffe<sup&gt; (6)</sup&gt;. Der Test wird im Laufe eines 4 Tage Zeitraum durchgeführt, bestehend aus Vor-Inkubation, 60 Minuten Exposition, 42 Stunden post-Inkubation und MTT-Assay Lebensfähigkeit. Nach Erhalt Gewebe und Übernachtung Vorinkubation (Tag 0), sind Gewebe topisch auf die Prüfsubstanz (Tag 1), die flüssige, halbfeste, feste oder Wachs werden ausgesetzt. Drei Gewebe sind für jede Testchemikalie, sowie für die positive Kontrolle (5% aq. SDS-Lösung), und eine negative Kontrolle (DPBS) verwendet. Chemische Belastung dauert 60 Minuten, 35 min, von denen das Gewebe in einem Inkubator bei 37 ° C gehalten Die Testsubstanzen werden dann von der Gewebeoberfläche durch ein umfangreiches Waschvorgang entfernt. Das Gewebe-Einsätze sind ausgelöscht und in frischem Medium. Nach einem 24 Stunden Inkubationszeit (Tag 2), ist das Medium ausgetauscht. Das Medium kann für die weitere Analyse von Zytokinen oder anderen Endpunkte von Interesse gespeichert werden. Nachdem das Medium austauschen, sind Gewebe für weitere 18 Stunden inkubiert. Am Ende des gesamten 42h post-Inkubation (Tag 3), sind die Gewebe in gelben MTT-Lösung überführt und für 3 Stunden. Der resultierende violett-blauen Formazan-Salz, vor allem von mitochondrialen Stoffwechsels gebildet wird, ist für 2 Stunden mit Isopropanol extrahiert. Die optische Dichte der extrahierten Formazan wird mit einem Spektralphotometer. Eine Chemikalie wird als reizend, wenn die Lebensfähigkeit des Gewebes in Bezug auf die negative Kontrolle behandelten Gewebe unter 50% reduziert eingestuft. Dieses Verfahren kann als voller Ersatz der in vivo Kaninchen auf Hautreizungen getestet Gefahrenerkennung und Kennzeichnung von Chemikalien im Einklang mit EU-Vorschriften eingesetzt werden<sup&gt; (7)</sup&gt;.

In diesem Video zeigen wir die EpiDerm Test auf Hautreizung (EpiDerm SIT) entwickelt und validiert<em&gt; In-vitro-</em&gt; Hautreizungen Prüfung von Chemikalien, darunter kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe.

Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

Der EpiDerm-Hautreiztest (EpiDerm SIT) wurde entwickelt (1,2,3) und validiert (4,5), um In-vitro-Hautreiztests von Chemikalien durchzuführen, einschließlich ...

Epiderm ist ein in vitro rekonstruiertes Modell der menschlichen Epidermis, das aus normalen menschlichen Zellen gewonnen wurde und von der Matt Tech Corporation entwickelt wurde. Das nach EC VM validierte Epiderm-Hautreiztestverfahren ersetzt herkömmliche tierversuchsbasierte Tests für Produkte wie Kosmetika, Rohstoffe und industrielle Wirkstoffe, die mit der menschlichen Haut in Kontakt kommen. Dieser Test beginnt am Tag null, wenn das Hautreiztestkit und das Epiderm-Gewebe im Labor eintreffen und anschließend nach einer Übernacht-Inkubation in einem Testmedium präkonditioniert werden.Am ersten Tag wird die atypische Oberfläche des Epidermisgewebes eine Stunde lang einer potenziellen Reizsubstanz ausgesetzt, und am zweiten Tag wird die Reizsubstanz durch eine Waschung entfernt. Nach einer 24-stündigen Inkubation wird der Kulturinsert in frisches Medium verbracht, und das alte Medium kann zur Analyse freigesetzter Zytokine und Chemokine verwendet werden. Das Gewebe wird mit einer Verbindung namens MTT behandelt, die durch mitochondriale Reduktase in ein dunkelviolettes Formazan und Salz umgewandelt wird.Eine Aussage über die Zellviabilität wird bereitgestellt. Das Fehlen einer dunkelvioletten Färbung in der Probe ist ein Hinweis auf verminderte Vitalität. Wenn der kolorimetrische Wert für eine Testverbindung weniger als 50 % der negativen Kontrollen beträgt, kann die Testverbindung als Reizstoff eingestuft werden.Hallo, ich bin Helena Kava von Matt Corporation. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren für die In-vitro-Hautreizstoffprüfung unter Verwendung eines rekonstruierten humanen Hautmodells, Epiderm. Dieses Verfahren kann je nach regulatorischen Anforderungen als vollständiger oder teilweiser Ersatz für den In-vivo-Schnelltest zur Hautreizstoffprüfung eingesetzt werden.Dieses neue In-vitro-Verfahren kann zur Gefahrenidentifizierung und Kennzeichnung von Chemikalien und Rohkosmetikstoffen verwendet werden. Beginnen wir also. Epiderm wird aus menschlichen epidermalen Keratinozytenkulturen gewonnen, um ein dreidimensionales, mehrschichtiges und hochdifferenziertes Modell der menschlichen Epidermis zu bilden.Die Gewebe sind mitotisch und metabolisch aktiv, ahmen strukturell und biochemisch ihre in-vivo-Gegenstücke eng nach und tun dies mit gesicherter Reproduzierbarkeit, wie beim menschlichen Epidermis. Epiderm besteht aus organisierten basalen, spinösen und granulären Schichten sowie einer mehrschichtigen Stratum-corneum-Schicht. Letztere enthält interzelluläre lamellare Lipidschichten, die in Mustern angeordnet sind, die denen im In-vivo-Zustand analog sind.Diese Gewebe werden in einem serumfreien Medium kultiviert. Jedes Gewebe wächst in einem separaten Zellkulturinsert. Andere Konfigurationen sind erhältlich, einschließlich eines 96-Loch-Hochdurchsatzformats.Die Gewebeherstellung dauert etwa drei Wochen. An einem bestimmten Punkt dieses Prozesses wird das Gewebe an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche angehoben, und die gesamte Flüssigkeit wird von der apikalen Oberfläche des Gewebes entfernt. Die Gewebe werden ausschließlich über die basolaterale Oberfläche ernährt, die weiterhin mit dem proprietären Kulturmedium von MatTek in Kontakt bleibt. Ein typisches Epiderm-Kit enthält 24 Gewebe, jedes mit einem Durchmesser von neun Millimetern, in separaten Gewebekultur-Inserts sowie ausreichend Testmedium, um diesen Hautreiztest durchzuführen.Die 24 Inserts sind fest in das mit Medium getränkte AGA-Rose-Gel eingesetzt, jeweils ein Gewebe pro Vertiefung einer standardmäßigen 24-Loch-Platte. Der Versand erfolgt per Overnight-Transportdienst bei einer Temperatur von drei bis vier Grad Celsius, bevor mit der Prüfung von Chemikalien begonnen wird. Unter Verwendung des EPIDERM-Testsystems bereiten Sie alle im Assay verwendeten Instrumente und Werkzeuge gemäß der schriftlichen Anleitung vor und sterilisieren diese. Ein Teil der Materialien, wie etwa Wattestäbchen, sollte in steriler Verpackung geliefert werden oder mittels Autoklavierung sterilisiert werden.70 % Ethanol sollte zur Sterilisation von Instrumenten wie Pinzetten verwendet werden, und UV- oder Gammabestrahlung sollte zur Sterilisation der Waschflaschen eingesetzt werden. Zwei wichtige Lösungen, die im Assay verwendet werden, sollten vorbereitet werden: DPBS und eine 5 %ige SDS-Lösung. In destilliertem Wasser werden etwa zwei Liter steriles DPBS mit einem pH-Wert von sieben im Assay verwendet, wobei ein Kit 24 Epiderm-Gewebestücke enthält.Steriles DPBS dient als negativer Kontrollstoff sowie als Waschlösung. 5 % SDS sollte als positiver Kontrollstoff vorbereitet und verwendet werden. Der Hautreiztest beginnt nach Erhalt des EPIDERM EPI 200 SIT-Testkits.Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten des Kits auf ihre Integrität überprüft werden, und wenden Sie sich bei Bedenken unverzüglich an das Unternehmen Mat Tech. Falls alles vorhanden ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Um den Test zu beginnen, lassen Sie das mit dem Kit gelieferte Assay-Medium auf Raumtemperatur kommen. Erwärmen Sie es nicht im laminar flow hood vor.Bereiten Sie für jeweils drei Epiderm-Gewebetransplantate eine sterile 6-Loch-Platte vor und pipettieren Sie unter sterilen Bedingungen 0,9 Milliliter des Testmediums in jedes Loch. Öffnen Sie die Plastiktüte, die die 24-Loch-Platte mit den epidermalen Geweben enthält, unter steriler Luftzufuhr. Entfernen Sie die sterile Gaze und nehmen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig jeden Einsatz mit dem epidermalen Gewebe heraus.Entfernen Sie jegliche verbliebene Aros, die an den äußeren Seiten des Inserts haften, durch vorsichtiges Abtupfen auf steriler Gaze oder Filterpapier. Anschließend bringen Sie die Gewebe innerhalb der nächsten fünf Minuten in die leere sterile 24-Well-Platte ein. Prüfen Sie die Inserts visuell.Notieren Sie alle Gewebedefekte und überschüssige Feuchtigkeit auf der Oberfläche. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind.Optimale Gewebetransplantate. Sollten eine trockene Oberfläche aufweisen und frei von Ablösungen, unebenen Stellen oder überschüssiger Flüssigkeit an der Oberfläche sein. Anschließend die Oberfläche der Gewebe vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen trocknen.Berühren Sie das Gewebe möglichst nicht direkt. Kapillareffekte reichen aus, um nach dem Trocknen der Oberfläche die Feuchtigkeit von der Oberfläche zu entfernen. Übertragen Sie drei Gewebestücke in die oberste Reihe von jeweils sechs. Mikrotiterplatte vorbefüllt mit 0,9 Milliliter Testmedium. Entfernen Sie Luftblasen, die unter den Inserts eingeschlossen sind. Stellen Sie anschließend die Sechs-Loch-Platten mit den Inserts eine Stunde lang in den Inkubator.Vorinkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der ersten Vorinkubationszeit überführen Sie die Inserts aus den oberen in die unteren Vertiefungen der Sechs-Loch-Platte. Stellen Sie die Platten für eine Übernacht-Vorinkubation zurück in den Inkubator.Stellen Sie den restlichen Assay-Medium in den Kühlschrank. Nach der Übernacht-Vorinkubation können die Testchemikalien auf die Epiderm-Gewebeträger aufgetragen werden. Vor Beginn des Chemikalienexpositionsassays stellen Sie alle erforderlichen Geräte, Lösungen und Testchemikalien auf Raumtemperatur.Im sterilen Haubenraum alle Flaschen mit nicht sterilen Materialien abwischen, bevor sie in die Haube gestellt werden, mit 70 % Ethanol. Die sterilen Flaschen mit negativer Kontrolle DPBS, positiver Kontrolle 5 % SDS und destilliertem Wasser sollten ebenfalls in die Haube gestellt und auf Raumtemperatur gebracht werden. Ein großes Gefäß sollte für Abfälle bereitgestellt werden.Bereiten Sie pro Chemikalie eine sechsfach-Vertiefungsplatte vor, indem Sie nur die obere Reihe mit jeweils 0,9 Milliliter Assay-Medium befüllen. Beschriften Sie jede Platte mit der Gewebenummer und dem Namen des Chemikal. Ungefähr fünf Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber Chemikalien entfernen Sie die Sechs-Well-Platten mit den vorbehandelten Geweben aus dem Inkubator. Anschließend bewerten Sie visuell die Oberfläche der Gewebe.Entfernen Sie Feuchtigkeit mit sterilen Wattestäbchen und üben Sie keinen Druck auf die Gewebeoberfläche aus. Beschriften Sie abschließend die Deckel der 6-Loch-Platte mit den Codenummern oder Namen der Testsubstanzen. Testen Sie nicht mehr als sechs Chemikalien, einschließlich negativer und positiver Kontrollen, jeweils im Dreifachansatz in einem einzigen Testdurchlauf.Verwenden Sie eine chemische Applikation und ein Waschintervall von einer Minute für die Handhabung bekannter Testsubstanzen. Befolgen Sie die Anweisungen im Sicherheitsdatenblatt oder MSDS für codierte oder unbekannte Proben. Beachten Sie die chemischen Sicherheitsrichtlinien und verwenden Sie einen belüfteten Schrank.Tragen Sie Handschuhe und schützen Sie Augen und Gesicht. Dosieren Sie die Gewebe mit Chemikalien in Ein-Minuten-Abständen, um das Spülen der Testchemikalien nach der Exposition zu erleichtern. Bewahren Sie die Platten mit den dosierten Geweben bis zur Dosierung des letzten Gewebes im laminar flow-Gerät auf. Ein abgerundeter Pipettentipp wird während des gesamten Verfahrens verwendet, um das Gewebe und die Testverbindungen zu handhaben. Zum Erzeugen der abgerundeten Spitze für flüssige Testchemikalien kann ein Bunsenbrenner verwendet werden.Geben Sie 30 Mikroliter der flüssigen Prüfsubstanz direkt auf das Gewebe und starten Sie sofort den Timer, sodass er die verstrichene Zeit anzeigt. Legen Sie das Nylon-Netz auf die Oberfläche des Gewebes. Wenn der Timer eine Minute erreicht hat, geben Sie die zweite flüssige Verbindung hinzu. Verwenden Sie drei Gewebeproben pro Prüfchemikalie und geben Sie jede Verbindung im Abstand von jeweils einer Minute hinzu.Verwenden Sie zur Prüfung von halbfesten Stoffen eine Kolbenhubpipette, um 30 Mikroliter direkt auf das Gewebe aufzutragen. Falls erforderlich, verteilen Sie die Chemikalie mit einer Pasteurpipette, um die Größe dem Gewebe anzupassen. Unmittelbar vor der Applikation des festen Stoffes befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 Mikrolitern sterilem DPBS, um den Kontakt zwischen Gewebeoberfläche und Prüfchemikalie zu verbessern; füllen Sie eine scharfe Applikationsspatel mit 25 Milligramm mit dem fein gemahlenen Prüfmaterial. Tragen Sie die feste Testchemikalie auf die Gewebeoberfläche auf. Falls erforderlich, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um den Löffel vollständig zu entleeren. Schütteln Sie die Inserts vorsichtig, um die Verteilung der festen Substanz auf der Oberfläche zu verbessern.Sie können auch den kugelförmigen Kolben Ihrer Pipette verwenden, um die Größe des Gewebes anzupassen. Drücken Sie nicht auf die Gewebeoberfläche. Geben Sie abschließend DPBS als Negativkontrolle und 5 % SDS als Positivkontrolle ebenfalls im Dreifachansatz auf die Gewebeträger. Nach der Applikation auf das letzte Gewebe überführen Sie alle Platten für 35 ± 1 Minute in den befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius.Während dieser Inkubation stellen Sie sicher, dass alle für die Waschschritte benötigten Materialien im Sicherheitswerkbank bereitliegen. Nach der 35-minütigen Inkubation nehmen Sie alle Platten aus dem Inkubator, stellen sie in die sterile Sicherheitswerkbank und warten 60 Minuten, bis die chemische Exposition für das Gewebe der ersten Dosis abgeschlossen ist.Als Nächstes beginnen Sie mit dem Waschverfahren. Spülen Sie die Gewebe 15-mal mit steriler DPBS. Um jegliche Rückstände des Testmaterials zu entfernen, füllen Sie den Gewebeträger mit einem kontinuierlichen Strom von DPBS, der 1,5 Zentimeter entfernt von der Gewebeoberfläche zugeführt wird, und leeren Sie ihn anschließend.Stellen Sie sicher, dass der DPBS-Strahl nicht zu schwach ist, da sonst die Testsubstanz nicht entfernt wird. Beachten Sie, die einminütige Zeitvorgabe beim Waschen von vier Geweben mit einem Nylonnetz fünfmal einzuhalten, und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen Pinzette. Fahren Sie danach mit den verbleibenden 10 Spülgängen fort; nach dem 15. Spülgang spülen Sie, indem Sie den Insert mithilfe der Spülfalsche vollständig untergetaucht dreimal mit 150 Milliliter DPBS spülen und schütteln, um den Rest der Testsubstanz zu entfernen. Spülen Sie das Gewebe abschließend. Spülen Sie es einmal von der Innenseite und einmal von der Außenseite mit steriler DPBS. Entfernen Sie überschüssige DPBS vorsichtig durch Schwenken des Inserts und Abtupfen auf steriler Filterpapier.Überführen Sie anschließend die beladenen Gewebetranswell-Inserts in die neue sechswellige Platte, die zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt wurde. Denken Sie erneut daran, dass alle diese Schritte innerhalb des einen Minutenintervalls abgeschlossen sein müssen, um die Expositionszeit von 60 Minuten für jedes Exponat beizubehalten. Nachdem das letzte Gewebe gespült wurde, trocknen Sie vorsichtig die Oberfläche jedes Gewebes mit einem sterilen Wattestäbchen ab.Wenn Rückstände der Chemikalie noch auf der Oberfläche vorhanden sind, versuchen Sie, diese mit dem sterilen Wattestäbchen zu entfernen. Inkubieren Sie die Gewebe anschließend für die nächsten 24 Stunden im Inkubator. Notieren Sie den Startzeitpunkt der Inkubation im Dokumentationsblatt der Methoden.Notieren Sie außerdem alle verschiedenen Anwendungen im Methodendokumentationsbogen. Fügen Sie der von Mat Tech Corporation bereitgestellten Standardarbeitsanweisung für das Bewegen der Platten im Sicherheitswerkbank hinzu. Überführen Sie den Insert in den unteren Teil der mit 0,9 Milliliter Medium vorgefüllten Sechs-Loch-Platte.Sammeln Sie das Medium aus der oberen Reihe und pipettieren Sie es in eine vorbeschriftete 24-Well-Platte, die anschließend bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt wird. Die Analyse von Zytokinen und/oder Chemokinen, die in das Kulturmedium freigesetzt wurden, ist ein optionaler Schritt, der bis zur Analyse durchgeführt werden kann. Fahren Sie mit der Inkubation für weitere 18 ± 3 Stunden für den MTT-Assay fort und beschriften Sie 2 24-Well-Platten mit den chemischen Namen oder Codes.Beachten Sie, dass MTT toxisch ist, tragen Sie daher unbedingt Schutzhandschuhe beim Umgang damit. Bereiten Sie die MTT-Lösung vor, indem Sie das MTT-Konzentrat auftauen und es mit dem MTT-Verdünnungsmittel verdünnen.Lichtschutz beachten, da MTT lichtempfindlich ist, und innerhalb von zwei bis drei Stunden verwenden. Da MTT im Laufe der Zeit abbaut, pipettieren Sie 300 Mikroliter MTT-Medium in jedes Loch der 24-Loch-Platte. Entfernen Sie nun die 6-Loch-Platten aus dem Inkubator.Den Boden der Inserts auf Löschpapier abtupfen und sie in die 24-Loch-Platte überführen, die zuvor mit MTT vorgefüllt wurde. Die 24-Loch-Platte in den Inkubator stellen und drei Stunden inkubieren. Den Beginn der MTT-Inkubation im MDS streng dokumentieren und die Inkubationszeit von drei Stunden genau einhalten, um unterschiedliche MTT-Messwerte zu vermeiden. Sobald die MTT-Inkubation abgeschlossen ist, das MTT-Medium vorsichtig aus allen Vertiefungen mit einer Saugpumpe und einer Giftfallen-Absaugvorrichtung abziehen.Füllen Sie die Vertiefungen erneut mit DPBS auf und aspirieren Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe nach der letzten Aspiration trocken sind. Nach den Waschschritten überführen Sie die Inserts in eine neue 24-Loch-Platte und geben Sie vorsichtig mit einer Pipette zwei Milliliter Extraktionslösung in jedes Insert, um diese zu bedecken.Die Flüssigkeitssäule steigt über die oberen Ränder des Inserts hinaus und bedeckt somit das Gewebe von beiden Seiten vollständig. Versiegeln Sie die 24-Loch-Platte mit einem Wärmeversiegler oder Parafilm, um Extraktion und Verdunstung zu verhindern. Notieren Sie den Beginn der Extraktion im Methoden-Dokumentationsblatt und führen Sie die Extraktion mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln auf einem Plattenrührer durch. Sobald die Extraktionszeit abgeschlossen ist, durchstechen Sie die Inserts mit einer Injektionsnadel oder einer pipettenspitzenartigen Birnenspitze und lassen Sie den Extrakt in das ursprüngliche Loch laufen, aus dem das Insert entnommen wurde.Entsorgen Sie die durchstochenen Inserts und pipettieren Sie die Lösung im Well dreimal auf und ab, bis sie homogen ist. Ein Plattenschüttler, der auf 120 U/min eingestellt ist, kann ebenfalls für jedes Gewebe verwendet werden. Überführen Sie zwei Aliquots à 200 Mikroliter der blauen Formazanlösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte.Übertragen Sie die Duplikate gemäß dem festgelegten Plattendesign, das in der diesem Video-Protokoll beiliegenden Tabelle für die Leerwerte angegeben ist. Verwenden Sie ISO-Propanol, messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem 96-Well-Platten-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern, ohne einen Referenzfilter zu verwenden. Tragen Sie die Ergebnisse in die Tabelle ein, um eine automatische Berechnung der Ergebnisse zu ermöglichen.Berücksichtigen Sie Korrekturen aufgrund von Störungen durch die Testchemikalie, wie im begleitenden Protokoll beschrieben; eine Testchemikalie wird als Reizstoff eingestuft. Wenn die Gewebeviabilität in Prozent gleich oder kleiner als 50 % ist, nachdem eine spektralphotometrische Analyse durchgeführt wurde, der OD570 der NC-Gewebe größer oder gleich eins und kleiner oder gleich 2,5 ist, die mittlere Viabilität der PC-Gewebe, ausgedrückt als Prozentsatz der negativen Kontrollgewebe, kleiner als 20 % ist und die aus den individuellen prozentualen Gewebeviabilitäten von drei identisch behandelten Replikaten berechnete Standardabweichung (SD) kleiner als 18 % ist, können Verbindungen mit Zellviabilitätswerten unter 50 % als Reizstoffe eingestuft werden.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den validierten 60-Minuten-42-Stunden-Hautreizungstest mit dem rekonstruierten menschlichen Hautmodell Epiderm durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass der größte Teil des Tests unter sterilen oder aseptischen Bedingungen erfolgt. Falls eine Methodenänderung erforderlich ist oder Sie eine genauere Erläuterung einzelner Verfahrensschritte benötigen, zögern Sie bitte nicht, uns um Hilfe und Beratung zu bitten.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Bericht beschreiben wir die dreidimensionale Rekonstruktion der Haut Modell, das die menschliche Haut imitiert in der Architektur und Komposition. Melanozyten Physiologie, Melanom Progression und das Schicksal der dermalen Stammzellen untersucht worden mit der Haut zu rekonstruieren Modell. Das Modell ist auch nützlich als Werkzeug für die präklinische Arzneimittel Beurteilung.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Dieses Video beschreibt das detaillierte Protokoll zur Erstellung von in vitro 3D-Organotyp-Hautrekonstruktionen zur Untersuchung des Melanomverlaufs. Dieses Hautmodell ahmt sowohl die Architektur als auch die multizelluläre Komplexität von Organen in vivo nach.

Generierung organotypischer Vollhautrekonstruktionen: Ein Verfahren zur Erstellung eines 3D-Hautmodells anhand menschlicher Hautproben

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt. Mit einer eigens konstruierten automatisierten Aufwickelvorrichtung können präzise und reproduzierbare Wunden unter Beibehaltung der Sterilität erzeugt werden.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Wir haben einen Test auf Augenreizung, die einen dreidimensionalen rekonstruierten menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodell nutzt entwickelt. Der Test ist in der Lage, zwischen den Augenreizstoffes und ätzende Stoffe (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und diejenigen, die nicht die Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) erfordern, zu unterscheiden.

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein umfassendes und detailliertes Protokoll darüber bereitzustellen, wie genetisch veränderte menschliche organotypische Haut aus epidermalen Keratinozyten und devitalisierter menschlicher Dermis erzeugt werden kann.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um dreidimensionale rekonstituierte menschliche Epidermis reproduzierbar und robust zu kultivieren. Zusätzlich charakterisiert es die Struktur-Funktions-Beziehung des epidermalen Barrieremodells. Die biologischen Reaktionen der rekonstituierten menschlichen Epidermis auf proinflammatorische Reize werden ebenfalls vorgestellt.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung und volumetrische Analyse von vaskularisierten menschlichen Hautäquivalenten unter Verwendung zugänglicher und einfacher Techniken für die Langzeitkultur zu beschreiben. Soweit möglich, wird die Begründung für die Schritte beschrieben, um den Forschern die Möglichkeit zu geben, sich an ihre Forschungsbedürfnisse anzupassen.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein dreidimensionales vereinfachtes und undifferenziertes Hautmodell unter Verwendung einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform zu generieren. Ein paralleler Strömungsansatz ermöglicht die In-situ-Ablagerung eines Hautkompartiments für die Aussaat von Epithelzellen auf der Oberseite, die alle von Spritzenpumpen gesteuert werden.

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

Hier stellen wir Ihnen kostengünstige und einfache Verfahren vor, um verschiedene 3D-Hautmodelle für die Routineforschung in einem Zellkulturlabor einzuführen. Forscher können Modelle erstellen, die auf ihre Bedürfnisse zugeschnitten sind, ohne auf kommerziell erhältliche Modelle angewiesen zu sein.

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Anwendung organotypischer Gewebemodelle zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro. Konkret verwendet das beschriebene Modellsystem ein mehrschichtiges orales Epithel, das Mikroorganismen ausgesetzt ist, die mit Biofilmen (Zahnbelag) im Zusammenhang mit Mundgesundheit versus -erkrankung assoziiert sind.

Organotypische Gewebemodellsysteme zur Untersuchung von Wirt-Erreger-Interaktionen in vitro

Lernen Sie den EpiDerm Skin Irritation Test zur Bewertung chemischer Hautreizung mit rekonstruierter humaner Epidermis. Diese validierte Methode ersetzt Tierversuche und ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für Kosmetik und Pharmazeutika.

Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

Weitere Videos entdecken