Ein In Vitro Skin Irritation Test (SIT) mit dem EpiDerm Rekonstruierte Human Epidermal (RHE) Model

Epiderm ist ein in vitro rekonstruiertes Modell der menschlichen Epidermis, das aus normalen menschlichen Zellen gewonnen wurde und von der Matt Tech Corporation entwickelt wurde. Das nach EC VM validierte Epiderm-Hautreiztestverfahren ersetzt herkömmliche tierversuchsbasierte Tests für Produkte wie Kosmetika, Rohstoffe und industrielle Wirkstoffe, die mit der menschlichen Haut in Kontakt kommen. Dieser Test beginnt am Tag null, wenn das Hautreiztestkit und das Epiderm-Gewebe im Labor eintreffen und anschließend nach einer Übernacht-Inkubation in einem Testmedium präkonditioniert werden.

Am ersten Tag wird die atypische Oberfläche des Epidermisgewebes eine Stunde lang einer potenziellen Reizsubstanz ausgesetzt, und am zweiten Tag wird die Reizsubstanz durch eine Waschung entfernt. Nach einer 24-stündigen Inkubation wird der Kulturinsert in frisches Medium verbracht, und das alte Medium kann zur Analyse freigesetzter Zytokine und Chemokine verwendet werden. Das Gewebe wird mit einer Verbindung namens MTT behandelt, die durch mitochondriale Reduktase in ein dunkelviolettes Formazan und Salz umgewandelt wird.

Eine Aussage über die Zellviabilität wird bereitgestellt. Das Fehlen einer dunkelvioletten Färbung in der Probe ist ein Hinweis auf verminderte Vitalität. Wenn der kolorimetrische Wert für eine Testverbindung weniger als 50 % der negativen Kontrollen beträgt, kann die Testverbindung als Reizstoff eingestuft werden.

Hallo, ich bin Helena Kava von Matt Corporation. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren für die In-vitro-Hautreizstoffprüfung unter Verwendung eines rekonstruierten humanen Hautmodells, Epiderm. Dieses Verfahren kann je nach regulatorischen Anforderungen als vollständiger oder teilweiser Ersatz für den In-vivo-Schnelltest zur Hautreizstoffprüfung eingesetzt werden.

Dieses neue In-vitro-Verfahren kann zur Gefahrenidentifizierung und Kennzeichnung von Chemikalien und Rohkosmetikstoffen verwendet werden. Beginnen wir also. Epiderm wird aus menschlichen epidermalen Keratinozytenkulturen gewonnen, um ein dreidimensionales, mehrschichtiges und hochdifferenziertes Modell der menschlichen Epidermis zu bilden.

Die Gewebe sind mitotisch und metabolisch aktiv, ahmen strukturell und biochemisch ihre in-vivo-Gegenstücke eng nach und tun dies mit gesicherter Reproduzierbarkeit, wie beim menschlichen Epidermis. Epiderm besteht aus organisierten basalen, spinösen und granulären Schichten sowie einer mehrschichtigen Stratum-corneum-Schicht. Letztere enthält interzelluläre lamellare Lipidschichten, die in Mustern angeordnet sind, die denen im In-vivo-Zustand analog sind.

Diese Gewebe werden in einem serumfreien Medium kultiviert. Jedes Gewebe wächst in einem separaten Zellkulturinsert. Andere Konfigurationen sind erhältlich, einschließlich eines 96-Loch-Hochdurchsatzformats.

Die Gewebeherstellung dauert etwa drei Wochen. An einem bestimmten Punkt dieses Prozesses wird das Gewebe an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche angehoben, und die gesamte Flüssigkeit wird von der apikalen Oberfläche des Gewebes entfernt. Die Gewebe werden ausschließlich über die basolaterale Oberfläche ernährt, die weiterhin mit dem proprietären Kulturmedium von MatTek in Kontakt bleibt. Ein typisches Epiderm-Kit enthält 24 Gewebe, jedes mit einem Durchmesser von neun Millimetern, in separaten Gewebekultur-Inserts sowie ausreichend Testmedium, um diesen Hautreiztest durchzuführen.

Die 24 Inserts sind fest in das mit Medium getränkte AGA-Rose-Gel eingesetzt, jeweils ein Gewebe pro Vertiefung einer standardmäßigen 24-Loch-Platte. Der Versand erfolgt per Overnight-Transportdienst bei einer Temperatur von drei bis vier Grad Celsius, bevor mit der Prüfung von Chemikalien begonnen wird. Unter Verwendung des EPIDERM-Testsystems bereiten Sie alle im Assay verwendeten Instrumente und Werkzeuge gemäß der schriftlichen Anleitung vor und sterilisieren diese. Ein Teil der Materialien, wie etwa Wattestäbchen, sollte in steriler Verpackung geliefert werden oder mittels Autoklavierung sterilisiert werden.

70 % Ethanol sollte zur Sterilisation von Instrumenten wie Pinzetten verwendet werden, und UV- oder Gammabestrahlung sollte zur Sterilisation der Waschflaschen eingesetzt werden. Zwei wichtige Lösungen, die im Assay verwendet werden, sollten vorbereitet werden: DPBS und eine 5 %ige SDS-Lösung. In destilliertem Wasser werden etwa zwei Liter steriles DPBS mit einem pH-Wert von sieben im Assay verwendet, wobei ein Kit 24 Epiderm-Gewebestücke enthält.

Steriles DPBS dient als negativer Kontrollstoff sowie als Waschlösung. 5 % SDS sollte als positiver Kontrollstoff vorbereitet und verwendet werden. Der Hautreiztest beginnt nach Erhalt des EPIDERM EPI 200 SIT-Testkits.

Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten des Kits auf ihre Integrität überprüft werden, und wenden Sie sich bei Bedenken unverzüglich an das Unternehmen Mat Tech. Falls alles vorhanden ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Um den Test zu beginnen, lassen Sie das mit dem Kit gelieferte Assay-Medium auf Raumtemperatur kommen. Erwärmen Sie es nicht im laminar flow hood vor.

Bereiten Sie für jeweils drei Epiderm-Gewebetransplantate eine sterile 6-Loch-Platte vor und pipettieren Sie unter sterilen Bedingungen 0,9 Milliliter des Testmediums in jedes Loch. Öffnen Sie die Plastiktüte, die die 24-Loch-Platte mit den epidermalen Geweben enthält, unter steriler Luftzufuhr. Entfernen Sie die sterile Gaze und nehmen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig jeden Einsatz mit dem epidermalen Gewebe heraus.

Entfernen Sie jegliche verbliebene Aros, die an den äußeren Seiten des Inserts haften, durch vorsichtiges Abtupfen auf steriler Gaze oder Filterpapier. Anschließend bringen Sie die Gewebe innerhalb der nächsten fünf Minuten in die leere sterile 24-Well-Platte ein. Prüfen Sie die Inserts visuell.

Notieren Sie alle Gewebedefekte und überschüssige Feuchtigkeit auf der Oberfläche. Verwenden Sie keine defekten Gewebe oder Gewebe, die vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind.

Optimale Gewebetransplantate. Sollten eine trockene Oberfläche aufweisen und frei von Ablösungen, unebenen Stellen oder überschüssiger Flüssigkeit an der Oberfläche sein. Anschließend die Oberfläche der Gewebe vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen trocknen.

Berühren Sie das Gewebe möglichst nicht direkt. Kapillareffekte reichen aus, um nach dem Trocknen der Oberfläche die Feuchtigkeit von der Oberfläche zu entfernen. Übertragen Sie drei Gewebestücke in die oberste Reihe von jeweils sechs.

Mikrotiterplatte vorbefüllt mit 0,9 Milliliter Testmedium. Entfernen Sie Luftblasen, die unter den Inserts eingeschlossen sind. Stellen Sie anschließend die Sechs-Loch-Platten mit den Inserts eine Stunde lang in den Inkubator.

Vorinkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der ersten Vorinkubationszeit überführen Sie die Inserts aus den oberen in die unteren Vertiefungen der Sechs-Loch-Platte. Stellen Sie die Platten für eine Übernacht-Vorinkubation zurück in den Inkubator.

Stellen Sie den restlichen Assay-Medium in den Kühlschrank. Nach der Übernacht-Vorinkubation können die Testchemikalien auf die Epiderm-Gewebeträger aufgetragen werden. Vor Beginn des Chemikalienexpositionsassays stellen Sie alle erforderlichen Geräte, Lösungen und Testchemikalien auf Raumtemperatur.

Im sterilen Haubenraum alle Flaschen mit nicht sterilen Materialien abwischen, bevor sie in die Haube gestellt werden, mit 70 % Ethanol. Die sterilen Flaschen mit negativer Kontrolle DPBS, positiver Kontrolle 5 % SDS und destilliertem Wasser sollten ebenfalls in die Haube gestellt und auf Raumtemperatur gebracht werden. Ein großes Gefäß sollte für Abfälle bereitgestellt werden.

Bereiten Sie pro Chemikalie eine sechsfach-Vertiefungsplatte vor, indem Sie nur die obere Reihe mit jeweils 0,9 Milliliter Assay-Medium befüllen. Beschriften Sie jede Platte mit der Gewebenummer und dem Namen des Chemikal.

Ungefähr fünf Minuten vor der geplanten Exposition gegenüber Chemikalien entfernen Sie die Sechs-Well-Platten mit den vorbehandelten Geweben aus dem Inkubator. Anschließend bewerten Sie visuell die Oberfläche der Gewebe.

Entfernen Sie Feuchtigkeit mit sterilen Wattestäbchen und üben Sie keinen Druck auf die Gewebeoberfläche aus. Beschriften Sie abschließend die Deckel der 6-Loch-Platte mit den Codenummern oder Namen der Testsubstanzen. Testen Sie nicht mehr als sechs Chemikalien, einschließlich negativer und positiver Kontrollen, jeweils im Dreifachansatz in einem einzigen Testdurchlauf.

Verwenden Sie eine chemische Applikation und ein Waschintervall von einer Minute für die Handhabung bekannter Testsubstanzen. Befolgen Sie die Anweisungen im Sicherheitsdatenblatt oder MSDS für codierte oder unbekannte Proben. Beachten Sie die chemischen Sicherheitsrichtlinien und verwenden Sie einen belüfteten Schrank.

Tragen Sie Handschuhe und schützen Sie Augen und Gesicht. Dosieren Sie die Gewebe mit Chemikalien in Ein-Minuten-Abständen, um das Spülen der Testchemikalien nach der Exposition zu erleichtern. Bewahren Sie die Platten mit den dosierten Geweben bis zur Dosierung des letzten Gewebes im laminar flow-Gerät auf. Ein abgerundeter Pipettentipp wird während des gesamten Verfahrens verwendet, um das Gewebe und die Testverbindungen zu handhaben. Zum Erzeugen der abgerundeten Spitze für flüssige Testchemikalien kann ein Bunsenbrenner verwendet werden.

Geben Sie 30 Mikroliter der flüssigen Prüfsubstanz direkt auf das Gewebe und starten Sie sofort den Timer, sodass er die verstrichene Zeit anzeigt. Legen Sie das Nylon-Netz auf die Oberfläche des Gewebes. Wenn der Timer eine Minute erreicht hat, geben Sie die zweite flüssige Verbindung hinzu. Verwenden Sie drei Gewebeproben pro Prüfchemikalie und geben Sie jede Verbindung im Abstand von jeweils einer Minute hinzu.

Verwenden Sie zur Prüfung von halbfesten Stoffen eine Kolbenhubpipette, um 30 Mikroliter direkt auf das Gewebe aufzutragen. Falls erforderlich, verteilen Sie die Chemikalie mit einer Pasteurpipette, um die Größe dem Gewebe anzupassen. Unmittelbar vor der Applikation des festen Stoffes befeuchten Sie die Gewebeoberfläche mit 25 Mikrolitern sterilem DPBS, um den Kontakt zwischen Gewebeoberfläche und Prüfchemikalie zu verbessern; füllen Sie eine scharfe Applikationsspatel mit 25 Milligramm mit dem fein gemahlenen Prüfmaterial.

Tragen Sie die feste Testchemikalie auf die Gewebeoberfläche auf. Falls erforderlich, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um den Löffel vollständig zu entleeren. Schütteln Sie die Inserts vorsichtig, um die Verteilung der festen Substanz auf der Oberfläche zu verbessern.

Sie können auch den kugelförmigen Kolben Ihrer Pipette verwenden, um die Größe des Gewebes anzupassen. Drücken Sie nicht auf die Gewebeoberfläche. Geben Sie abschließend DPBS als Negativkontrolle und 5 % SDS als Positivkontrolle ebenfalls im Dreifachansatz auf die Gewebeträger. Nach der Applikation auf das letzte Gewebe überführen Sie alle Platten für 35 ± 1 Minute in den befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Während dieser Inkubation stellen Sie sicher, dass alle für die Waschschritte benötigten Materialien im Sicherheitswerkbank bereitliegen. Nach der 35-minütigen Inkubation nehmen Sie alle Platten aus dem Inkubator, stellen sie in die sterile Sicherheitswerkbank und warten 60 Minuten, bis die chemische Exposition für das Gewebe der ersten Dosis abgeschlossen ist.

Als Nächstes beginnen Sie mit dem Waschverfahren. Spülen Sie die Gewebe 15-mal mit steriler DPBS. Um jegliche Rückstände des Testmaterials zu entfernen, füllen Sie den Gewebeträger mit einem kontinuierlichen Strom von DPBS, der 1,5 Zentimeter entfernt von der Gewebeoberfläche zugeführt wird, und leeren Sie ihn anschließend.

Stellen Sie sicher, dass der DPBS-Strahl nicht zu schwach ist, da sonst die Testsubstanz nicht entfernt wird. Beachten Sie, die einminütige Zeitvorgabe beim Waschen von vier Geweben mit einem Nylonnetz fünfmal einzuhalten, und entfernen Sie das Netz vorsichtig mit der spitzen Pinzette. Fahren Sie danach mit den verbleibenden 10 Spülgängen fort; nach dem 15. Spülgang spülen Sie, indem Sie den Insert mithilfe der Spülfalsche vollständig untergetaucht dreimal mit 150 Milliliter DPBS spülen und schütteln, um den Rest der Testsubstanz zu entfernen.

Spülen Sie das Gewebe abschließend. Spülen Sie es einmal von der Innenseite und einmal von der Außenseite mit steriler DPBS. Entfernen Sie überschüssige DPBS vorsichtig durch Schwenken des Inserts und Abtupfen auf steriler Filterpapier.

Überführen Sie anschließend die beladenen Gewebetranswell-Inserts in die neue sechswellige Platte, die zuvor mit Assay-Medium vorgefüllt wurde. Denken Sie erneut daran, dass alle diese Schritte innerhalb des einen Minutenintervalls abgeschlossen sein müssen, um die Expositionszeit von 60 Minuten für jedes Exponat beizubehalten. Nachdem das letzte Gewebe gespült wurde, trocknen Sie vorsichtig die Oberfläche jedes Gewebes mit einem sterilen Wattestäbchen ab.

Wenn Rückstände der Chemikalie noch auf der Oberfläche vorhanden sind, versuchen Sie, diese mit dem sterilen Wattestäbchen zu entfernen. Inkubieren Sie die Gewebe anschließend für die nächsten 24 Stunden im Inkubator. Notieren Sie den Startzeitpunkt der Inkubation im Dokumentationsblatt der Methoden.

Notieren Sie außerdem alle verschiedenen Anwendungen im Methodendokumentationsbogen. Fügen Sie der von Mat Tech Corporation bereitgestellten Standardarbeitsanweisung für das Bewegen der Platten im Sicherheitswerkbank hinzu. Überführen Sie den Insert in den unteren Teil der mit 0,9 Milliliter Medium vorgefüllten Sechs-Loch-Platte.

Sammeln Sie das Medium aus der oberen Reihe und pipettieren Sie es in eine vorbeschriftete 24-Well-Platte, die anschließend bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt wird. Die Analyse von Zytokinen und/oder Chemokinen, die in das Kulturmedium freigesetzt wurden, ist ein optionaler Schritt, der bis zur Analyse durchgeführt werden kann. Fahren Sie mit der Inkubation für weitere 18 ± 3 Stunden für den MTT-Assay fort und beschriften Sie 2 24-Well-Platten mit den chemischen Namen oder Codes.

Beachten Sie, dass MTT toxisch ist, tragen Sie daher unbedingt Schutzhandschuhe beim Umgang damit. Bereiten Sie die MTT-Lösung vor, indem Sie das MTT-Konzentrat auftauen und es mit dem MTT-Verdünnungsmittel verdünnen.

Lichtschutz beachten, da MTT lichtempfindlich ist, und innerhalb von zwei bis drei Stunden verwenden. Da MTT im Laufe der Zeit abbaut, pipettieren Sie 300 Mikroliter MTT-Medium in jedes Loch der 24-Loch-Platte. Entfernen Sie nun die 6-Loch-Platten aus dem Inkubator.

Den Boden der Inserts auf Löschpapier abtupfen und sie in die 24-Loch-Platte überführen, die zuvor mit MTT vorgefüllt wurde. Die 24-Loch-Platte in den Inkubator stellen und drei Stunden inkubieren. Den Beginn der MTT-Inkubation im MDS streng dokumentieren und die Inkubationszeit von drei Stunden genau einhalten, um unterschiedliche MTT-Messwerte zu vermeiden. Sobald die MTT-Inkubation abgeschlossen ist, das MTT-Medium vorsichtig aus allen Vertiefungen mit einer Saugpumpe und einer Giftfallen-Absaugvorrichtung abziehen.

Füllen Sie die Vertiefungen erneut mit DPBS auf und aspirieren Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang noch zweimal und stellen Sie sicher, dass die Gewebe nach der letzten Aspiration trocken sind. Nach den Waschschritten überführen Sie die Inserts in eine neue 24-Loch-Platte und geben Sie vorsichtig mit einer Pipette zwei Milliliter Extraktionslösung in jedes Insert, um diese zu bedecken.

Die Flüssigkeitssäule steigt über die oberen Ränder des Inserts hinaus und bedeckt somit das Gewebe von beiden Seiten vollständig. Versiegeln Sie die 24-Loch-Platte mit einem Wärmeversiegler oder Parafilm, um Extraktion und Verdunstung zu verhindern. Notieren Sie den Beginn der Extraktion im Methoden-Dokumentationsblatt und führen Sie die Extraktion mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln auf einem Plattenrührer durch. Sobald die Extraktionszeit abgeschlossen ist, durchstechen Sie die Inserts mit einer Injektionsnadel oder einer pipettenspitzenartigen Birnenspitze und lassen Sie den Extrakt in das ursprüngliche Loch laufen, aus dem das Insert entnommen wurde.

Entsorgen Sie die durchstochenen Inserts und pipettieren Sie die Lösung im Well dreimal auf und ab, bis sie homogen ist. Ein Plattenschüttler, der auf 120 U/min eingestellt ist, kann ebenfalls für jedes Gewebe verwendet werden. Überführen Sie zwei Aliquots à 200 Mikroliter der blauen Formazanlösung in eine 96-Well-Flachboden-Mikrotiterplatte.

Übertragen Sie die Duplikate gemäß dem festgelegten Plattendesign, das in der diesem Video-Protokoll beiliegenden Tabelle für die Leerwerte angegeben ist. Verwenden Sie ISO-Propanol, messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem 96-Well-Platten-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern, ohne einen Referenzfilter zu verwenden. Tragen Sie die Ergebnisse in die Tabelle ein, um eine automatische Berechnung der Ergebnisse zu ermöglichen.

Berücksichtigen Sie Korrekturen aufgrund von Störungen durch die Testchemikalie, wie im begleitenden Protokoll beschrieben; eine Testchemikalie wird als Reizstoff eingestuft. Wenn die Gewebeviabilität in Prozent gleich oder kleiner als 50 % ist, nachdem eine spektralphotometrische Analyse durchgeführt wurde, der OD570 der NC-Gewebe größer oder gleich eins und kleiner oder gleich 2,5 ist, die mittlere Viabilität der PC-Gewebe, ausgedrückt als Prozentsatz der negativen Kontrollgewebe, kleiner als 20 % ist und die aus den individuellen prozentualen Gewebeviabilitäten von drei identisch behandelten Replikaten berechnete Standardabweichung (SD) kleiner als 18 % ist, können Verbindungen mit Zellviabilitätswerten unter 50 % als Reizstoffe eingestuft werden.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den validierten 60-Minuten-42-Stunden-Hautreizungstest mit dem rekonstruierten menschlichen Hautmodell Epiderm durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass der größte Teil des Tests unter sterilen oder aseptischen Bedingungen erfolgt. Falls eine Methodenänderung erforderlich ist oder Sie eine genauere Erläuterung einzelner Verfahrensschritte benötigen, zögern Sie bitte nicht, uns um Hilfe und Beratung zu bitten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.