Name: Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Erfahren Sie das Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokoll zur Analyse menschlicher Spermien für die Aneuploidie-Screening in der klinischen Diagnostik. Diese Methode unterstützt die Bewertung genetischer Risiken bei männlicher Infertilität.

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Diese Arbeit wurde von der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Die Autoren danken J. Blanco und F. Vidal für ihre Überwachung und Ermutigung, und J. Lucas für seine technische Unterstützung.

I. Aufbereitung der Probe und Zellfixierung <ol><li> Verlassen Sie die Samenprobe in sterilen Behältern bei Raumtemperatur für 20 Minuten, bis Verflüssigung. </li><li> Übertragen Sie die Probe in ein Zentrifugenröhrchen und spinnen sie bei 1000g für 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen mit einer Pasteurpipette. </li><li> Add hypotonischen Lösung (KCl, 0,075 M) vorgewärmt auf 37 ° C, Tropfen für Tropfen, beim Mischen auf einem Vortex auf ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. </li><li> Das Röhrchen wird in ein Wasserbad bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Zentrifugation bei 1000g für 5 Minuten. Vorsichtig den Überstand verwerfen durch Dekantieren, ohne das Pellet. </li><li> Nach Resuspendieren des Pellets, fügen Sie frisch zubereitete Carnoy Fixativ (3:1 Methanol: Essigsäure) tropfenweise unter Mischen auf einem Vortex auf ein Endvolumen von 8 ml zu erhalten. </li><li> Wiederholen Sie die Punkte 6 und 7 so oft wie notwendig, um ein weißes Pellet zu erhalten. </li><li> Fügen Sie frisch zubereitete Methanol: Essigsäure (3:1) tropfenweise auf das Endvolumen auf die zelluläre Konzentration für den Erhalt von guten Zellausbreitung (in diesen Fällen mit einem kleinen Pellets erforderlich einstellen, werden nur wenige Tropfen genügen, wohingegen Proben mit einem hohen Anteil von Spermien erholt, kann das Endvolumen erreicht 1-2 ml). Ein Test gleiten kann, indem er die resuspendierten Probe auf eine ungefettete Rutsche und prüft es unter einem Phasenkontrast-Mikroskop vorgenommen werden. Auf diese Weise können die zelluläre Dispersion überprüfen und würde es korrigieren, wenn es notwendig ist, in weiteren Dias. </li><li> Um die Erweiterungen, fallen aus einer Höhe von mindestens 40 cm zwei oder drei Tropfen der Zellsuspension in die Mitte des unfrosted Dias (zuvor in Methanol bei -20 ° C gelagert, um sie zu entfetten). Machen So aktivieren Sie den Ort der Probe in das Protokoll, markieren Sie den Bereich mit den Spermien-Erweiterung auf der gegenüberliegenden Seite der Folie mit einem Diamant-Bleistift. </li><li> Bewahren Sie die Objektträger bei -20 ° C für mindestens 24 Stunden. Hinweis: Die Zugabe von Methanol: Essigsäure (3:1) tropfenweise unter Mischen ist ein sehr wichtiger Schritt, um die Bildung von Spermien Aggregate zu vermeiden. </li></ol> II. Dekondensation <ol><li> Die Objektträger bei -20 ° C gelagert muss abgetaut, um mit dem Protokoll fortgesetzt werden (lassen Sie sie bei Raumtemperatur). </li><li> Legen Sie die Folie in zwei aufeinander folgenden Färbetrog mit 2x Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Lösung (2 × SSC) für jeweils 3 Minuten. </li><li> Die Objektträger durch eine Reihe von Ethanol wäscht für 2 Minuten in jede Coplin Glas. Beginnen Sie mit 70% Ethanol, folgen um 90% und endet mit 100%. Dry die Rutsche verlassen Sie es bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Folie in Dithiothreitol-Lösung (1,4-Dithiothreitol 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroxymethyl) -1,3-propandiol 50 mM) bei 37 ° C in den Brutschrank, um das Chromatin decondense. Dieses Produkt wirkt durch Aufbrechen der Disulfidbrücken der Protamine, dass die Spule der DNA in den Spermien Zellkern. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt, weil die DNA in den Spermien Zellkern stark verdichtet wird. Die Inkubationszeit der Folien in Dithiothreitol-Lösung (DTT) muss nach dem Muster der Reaktivität zu diesem Artikel eingestellt werden. Normalerweise ist diese Zeit ca. 8 Minuten, obwohl es 2 bis 15 Minuten variieren. </li><li> Unmittelbar, übertragen Sie die Folie an zwei aufeinander folgenden Färbetrog mit 2 × SSC für 3 Minuten in jeder Coplin. </li><li> Weiter, indem die Folie durch eine Reihe von Ethanol wäscht für 2 Minuten in jede Coplin Glas (70%, 90% und 100% Ethanol). Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur. Hinweis: Übermäßige DTT wäre in disperser FISH-Signale am Ende des Verfahrens führen, während eine zu kurze Belichtung in einem Mangel an bestimmten Signalen führen würde. </li></ol> III. Hybridisierung <ol><li> Denaturieren Spermien-DNA durch Inkubation der Folie in einer Coplin Glas mit Formamid-Lösung (70% Formamide/2xSSC) bei 73 ° C für 5 Minuten. </li><li> Die Objektträger durch Ethanol-Lösungen für 1 Minute pro Coplin jar (Beginn mit 70% Ethanol, 85% und Finish mit 100%). Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie direkt 5 l des entsprechenden ready-to-use-Sonde Mischung zu einem 15x15 Deckglas (AneuVysion Assay Multi-Farb-Probe Panel: CEP 18/X/Y oder LSI 13/21). </li><li> Wie es in dem Video zu sehen ist, legen Sie vorsichtig die Folie auf das Deckglas, um gemeinsam das Zielgebiet und die Sonde Mischung. Seal es mit Gummi-Zement. </li><li> Legen Sie die Folie in einen vorgewärmten 37 ° C Hybridisierung Kammer (HYBrite ™) und inkubieren bei 37 ° C für 6-24 Stunden. Hinweis: Während der Denaturierung der Spermaprobe ist zwingend erforderlich, die Notwendigkeit der Denaturierung der Sonden wird vom Hersteller bestimmt. Die Sonde Mischungen im Sinne dieses Protokolls sind gebrauchsfertig und in diesem Fall Sonde Denaturierung ist nicht erforderlich. Das Volumen der Sonde Mischung wird je nach Größe der hybridisierten Bereich variieren. </li></ol> IV. WäschtPost-Hybridisierung <ol><li> Nehmen Sie die Folie aus der Hybridisierung Kammer. </li><li> Entfernen Sie die Gummi-Zement und vorsichtig das Deckglas Schiebetüren sanft zur Seite. </li><li> Zur Beseitigung der unspezifischen Hybridisierungssignale Ort der Schieber für 2 Minuten in einem Coplin Glas mit 0.4xSSC/0.3% NP-40 vorgewärmt auf 73 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Übertragen Sie die Folie an eine 2xSSC/0.1% NP-40-Waschlösung bei Raumtemperatur für 1 Minute. Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie eine Gegenfärbung Produkt der Zielregion (8 l für ein 18x18 Deckglas). Die häufigste Produkt verwendet wird 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.). </li><li> Wie es in dem Video zu sehen ist, decken die hybridisierte Region mit einem Deckglas (die Hybridisierung des Deckglases mit Nagellack versiegelt werden können erhalten). </li><li> Shop hybridisierten Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln, bis ihre Aussicht Analyse. Unter diesen Bedingungen die Folien können bis zu 12 Monate ohne in Fluoreszenzsignalintensität signifikante verloren gespeichert werden. Hinweis: Eine höhere Temperatur oder eine übermäßige Waschzeit kann bei der Beseitigung von einigen Signalen führen, während das Gegenteil nicht waschen würde aus unspezifischen Sonde Hybridisierungen. Das Volumen der Gegenfärbung Produkt zugesetzt werden nach der Größe der Hybridisierung Bereich zur Deckung variieren. </li></ol> V. Visualisierung Die Präparate können unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem Triple-Band-Filter für DAPI / Texas Red / FITC und Single-Band-Filter für Aqua, FITC und Texas Red ausgestattet ausgewertet werden. Standard-Bewertungskriterien muss für die korrekte Auswertung der Spermakerne 1 gefolgt werden. Die Vorbereitung mit Sonden für die Chromosomen X, Y und 18 hybridisiert sollten Signale für diese drei Chromosomen-Display. Jeder normale Spermien müssen zeigen eine blaue Signal (entspricht dem Chromosom 18) und ein grünes Signal (X-tragenden Spermien) oder ein rotes Signal (Y-Spermien). In der Vorbereitung mit Sonden für die Chromosomen 13 und 21, ein grünes Signal für das Chromosom 13 und ein rotes Signal für Chromosom 21 hybridisiert sollte in jedem normalen Spermien unterschieden werden.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die menschliche Samenproben für den Erhalt von Spermien FISH Präparate Prozess. Mit diesem Protokoll ist es möglich, chromosomale Anomalien bei männlichen Keimzellen zu analysieren. Spermatozoen Aneuploidietestung hat Anwendungen entweder im Rahmen der Grundlagenforschung und in der reproduktiven Beratung der unfruchtbaren Männer. Obwohl in der klinischen Diagnostik der am häufigsten untersuchten Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21, andere kommerzielle Sonden für eine breite Palette von Chro...

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Material</td><td>Roche-Gruppe</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td><td>Material</td><td>Roche-Gruppe</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Multicolor-DNA-Sonden-Kit&lt;ul style=&quot;Abstand:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Salz-Natriumcitrat&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;CEP 18/X/Y DNA-Sonde&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;LSI 13/21 DNA-Sonde&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Material</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;Abstand:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5804R</td><td>Werkzeug</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Material</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Becher (Glas)</td><td>Material</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Becher (Plastik)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (15x15)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (18x18)</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Diamantstift</td><td>Material</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Material</td><td>Roche-Gruppe</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank</td><td>Werkzeug</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Material</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Werkzeug</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsoel</td><td>Material</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Werkzeug</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Material</td><td>Merck &amp;& Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Material</td><td>Labsystems</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitze zum Austauschen</td><td>Material</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Material</td><td>Quo-Kosmetik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Werkzeug</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Ausgestattet mit einem Dreifachbandfilter für DAPI/Texas Red/FITC und Einzelbandfiltern für Aqua, FITC und Texas Red.</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette</td><td>Material</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop</td><td>Werkzeug</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikpipette (3 ml)</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Material</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Kautschukkleber</td><td>Material</td><td>Best-Test</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparate</td><td>Material</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Schieber-Aufbewahrungsboxen</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Behälter</td><td>Material</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Material</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Material</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Dreifach destilliertes Wasser</td><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Material</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Material</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Vertikale laminare Strömung &lt;em&gt;Fluoreszenzhaube&lt;/em&gt;</td><td>Werkzeug</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mixer</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Werkzeug</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenz in situ hybridisierung (fish)-protokoll in menschlichen spermien

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidien sind die häufigsten Chromosomenstörungen beim Menschen. Die meisten dieser Veränderungen ergeben sich aus meiotischen Fehler bei der gametogenic Prozess bei den Eltern. In der menschlichen Männchen, können diese Fehler auf die Produktion von Spermien mit numerischen Chromosomenanomalien, die eine erhöhte Gefahr der Übertragung dieser Anomalien auf die Nachkommen vertreten führen. Aus diesem Grund hat die Technik der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf Spermakerne zu einem Protokoll weithin im Zusammenhang mit der klinischen Diagnose integriert. Diese Praxis liefert eine Schätzung der Frequenzen von numerischen Chromosomenanomalien in den Keimzellen der Patienten, die zur genetischen Reproduktion Rat zu suchen. Bis heute sind die Chromosomen am häufigsten in Spermien FISH Analyse mit einbezogen Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21. Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie zu verarbeiten und zu befestigen ein menschliches Sperma Probe, wie man decondense und denaturieren die Spermien Chromatin, wie es weitergehen soll, um Spermien FISH Präparate zu erhalten, und wie die Ergebnisse am Mikroskop sichtbar zu machen. Besondere Hinweise über die wichtigsten Schritte gegeben werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie man eine Samenprobe Prozess zu einer qualitativ hochwertigen Fluoreszenz zu erreichen<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf menschliche Spermien. Die Vorbereitungen erhalten können Aneuploidietestung im Zusammenhang mit der klinischen Diagnose verwendet werden.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidien sind die häufigsten chromosomalen Aberrationen beim Menschen. Die meisten dieser Aberrationen resultieren aus meiotischen Fehlern während der gametogenen ...

Das Protokoll zur Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in menschlichen Spermakernen wurde in der klinischen Diagnostik weitgehend etabliert. Eine Anwendung dieser Methodik ist die Ploidie-Screening von Spermatozoen. Im Rahmen der Beratung bei Unfruchtbarkeit bei Männern ist das Vorkommen numerischer Aberrationen bei diesen Individuen höher als in der Gesamtbevölkerung, und sie weisen häufig abnorme Samenparameter auf.Dies stellt ein erhöhtes Risiko dar, diese Anomalien an Nachkommen weiterzugeben. Heute werden wir die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nach Dekondensation der Spermienkerne zur Analyse der Chromosomen 13, 18, 21, X und Y veranschaulichen. Sobald die Probe gesammelt wurde, sollte sie bis zur Verflüssigung 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Um mit dem Protokoll zu beginnen, muss die Probe in ein Zentrifugenröhrchen überführt werden.Die Lösungen, die wir im ersten Teil des Experiments verwenden, sind hypertonisch, auf 37 Grad C vorgewärmt und bestehen aus Methanol und Essigsäure im Verhältnis drei zu eins. Diese müssen frisch hergestellt werden. Anschließend ist die Probe bereit, fünf Minuten lang mit tausend G zu zentrifugieren.Entfernen Sie nun vorsichtig den Überstand und geben Sie die hypertonische Lösung Tropfen für Tropfen hinzu, bis ein Volumen von etwa 10 Milliliter erreicht ist. Dieses Reagenzglas muss 30 Minuten lang bei 37 Grad C verbleiben, anschließend muss die Probe erneut zentrifugiert werden. Durch die Zentrifugation sammeln sich die Spermatozoen am Boden des Reagenzglases, wodurch wir die hypotonische Lösung durch Methanol ersetzen können.Die Essigsäure-Zentrifugation muss so oft wiederholt werden, wie nötig, um die Methanol-Essigsäure-Lösung mehrmals auszuwechseln, bis ein weißes Pellet erhalten wird. Sobald dies der Fall ist, muss frische Methanol-Essigsäure-Lösung hinzugefügt werden. Das Endvolumen sollte entsprechend der gewünschten Zellverteilung bei nachfolgenden Schritten angepasst werden.Der letzte Schritt besteht darin, die Ausstriche herzustellen, indem die fixierte Probe auf Reed-Objektträger, die in Methanol bei minus 20 Grad C aufbewahrt werden, abgetropft wird. Es ist hilfreich, den Bereich des Objektträgers, der die Spermienausstriche enthält, für zukünftige Lokalisierungen zu markieren. Dies kann mithilfe eines Diamantstifts auf der Rückseite des Objektträgers leicht durchgeführt werden. Sobald eine optimale zelluläre Verteilung bestätigt wurde, sollten die Objektträger mindestens 24 Stunden lang bei minus 20 Grad C gelagert werden.Bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren. In diesem Teil des Experiments werden wir Salzlösung, Natriumcitratlösung, eine Ethanolreihe, DRE, fatales und fides verwenden. Nachdem die Objektträger aufgetaut wurden, müssen die fixierten Proben gewaschen und durch Eintauchen in zwei aufeinanderfolgende Coplin-Flaschen, die jeweils zweifache SSC enthalten, dehydriert werden.Dies dauert drei Minuten für jeden Coplan. Anschließend müssen die Objektträger in der Reihenfolge steigender Konzentration jeweils zwei Minuten lang in die Ethanol-Coplan-Gefäße getaucht werden. Zu diesem Zeitpunkt müssen die Objektträger getrocknet werden, um mit den folgenden Schritten fortzufahren.Da die DNA im Spermiumkern stark kompaktiert ist, muss das Chromatin vor der Denaturierung entfaltet werden. Dies kann mit einer DTT-Lösung bei 37 Grad C durchgeführt werden. Dieses Produkt wirkt, indem es die Disulfidbrücken des Protamins spaltet, das die DNA im Kern der Spermatozoen umwickelt. Die Inkubationszeit des Objektträgers in DTT muss je nach Reaktivität der Spermaprobe gegenüber diesem Produkt angepasst werden.In der Regel dauert dies etwa acht Minuten, kann jedoch zwischen zwei und 15 Minuten variieren. Nach dieser Zeit müssen die Objektträger sofort zweimal für jeweils drei Minuten in 2× SSC überführt werden, gefolgt von jeweils zwei Minuten in jedem der Ethanol-Coplan-Gläser. Für die Sondenhybridisierung ist es unerlässlich, mit einzelsträngigen DNA-Strängen zu arbeiten. Dies erfordert eine Denaturierungsstufe vor der Zugabe der Sonden, die eine Inkubationszeit von fünf Minuten in einer Formamidlösung bei 73 °C umfasst. Zum Abschluss der Objektträgerbehandlung ist eine letzte Überführung in die Ethanol-Lösung erforderlich, wobei die Objektträger je Coplan-Glas für eine Minute eingetaucht werden.Die Objektträger sind anschließend bereit, in FISH-Analysen verwendet zu werden, die für die klinische Diagnostik durchgeführt werden. Zu den am häufigsten untersuchten Chromosomen gehören die Geschlechtschromosomen sowie die Chromosomen 13, 18 und 21. Zur Analyse dieser Chromosomen verwenden wir ein mehrfarbiges DNA-Sonden-Kit von vices.Dieses enth&auml;lt ein R&ouml;hrchen mit einer Sondenkombination f&uuml;r die Alpha-Satellitenregion der Chromosomen X, Y und 18, die jeweils gr&uuml;n und aqua markiert sind, sowie ein weiteres R&ouml;hrchen mit einer Kombination von Sonden f&uuml;r die Chromosomen 13 und 21, die jeweils gr&uuml;n und orange markiert sind. Die Menge der hinzugef&uuml;gten Sondenmischung variiert je nach Gr&ouml;&szlig;e des Hybridisierungsbereichs als Referenz f&uuml;r ein Deckglas von 15 mal 15. Ein Volumen von f&uuml;nf Mikrolitern ist ausreichend.Beide Sondenmischungen werden zur vereinfachten Handhabung vorab in einem Hybridisierungspuffer denaturiert, sodass sie direkt zu den dekondensierten und denaturierten Objektträgern hinzugefügt werden können. Es sind außerdem andere kommerzielle Sonden für eine breite Palette von Chromosomen und Loki erhältlich, die in diesen Experimenten verwendet werden können. Gewöhnlich erfordern diese Sonden jedoch eine Vorbehandlung zur Denaturierung, bevor die Mischung zur Zielprobe gegeben wird.In diesen Situationen genügt es, den Herstelleranweisungen zu folgen. Der Zielbereich muss mit einem Deckglas abgedeckt und mit Kautschukzement versiegelt werden. Anschließend werden die Objektträger in die Hybridisierungskammer gegeben, die vorab auf 37 Grad C vorgewärmt wurde, und sechs bis 24 Stunden bei dieser Temperatur inkubiert.Im letzten Teil des Protokolls verwenden wir diese beiden Waschlösungen, die aus unterschiedlichen Konzentrationen von Salin-Natrium-Citrat-Lösung und dem Tensid NP 40 bestehen. Nach der Inkubationszeit können die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entfernt werden, um den Gummizement zu beseitigen. Anschließend wird vorsichtig der Deckglaser entfernt.Wie gezeigt, werden die Objektträger zwei Minuten lang in die erste Waschlösung, die auf 73 °C vorgewärmt wurde, getaucht. Anschließend werden sie für eine weitere Minute in die zweite Waschlösung bei Raumtemperatur überführt. Diese beiden Waschschritte helfen uns, unspezifische Hybridisierungssignale zu eliminieren. Nach diesen beiden Waschungen müssen wir warten, bis die Objektträger vollständig getrocknet sind, um den letzten Schritt des Protokolls abzuschließen.An dieser Stelle wird ein Gegenfärbemittel hinzugefügt, um die Visualisierung des Zellkerns zu erleichtern. Eines der gebräuchlichsten Produkte für diesen Zweck ist dpi. Die zugegebene Menge muss ebenfalls an die Größe des hybridisierten Bereichs angepasst werden, wobei eine Deckglasgröße von 18 mal 18 als Referenz dient.Ein Volumen von acht Mikrolitern DPI ist ausreichend. Der Deckel kann mit Nagellack versiegelt werden, und nun sind die Präparationen zur Visualisierung bereit. Alternativ können sie bis zur späteren Analyse bei minus 20 Grad C gelagert werden.Das Mikroskop, das wir für die Visualisierung verwenden werden, ist ein Olympus BX 60 Epi-Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem Dreifach-Bandfilter für DAPI, Texas Red und FITC sowie Einzelbandfiltern für Aqua-FITC und Texas Red. Durch den Dreifach-Bandfilter erscheinen die Präparate, die mit x, Y und 18 hybridisiert wurden, als Signale für diese drei Chromosomen. Mithilfe des Einzelbandfilters für Aqua können wir ausschließlich die fluoreszierenden Signale für Chromosom 18 visualisieren. In jedem normalen Spermatozoon sollte eines dieser Signale zu erwarten sein.Bei Verwendung des Einzelbandfilters jedoch ausschließlich für FITC zeigen einige Spermatozoen ein fluoreszierendes grünes Signal, das dem X-Chromosom entspricht. Die Spermatozoen, die das grüne Signal fehlt, sollten ein rotes Signal für das Y-Chromosom aufweisen, das spezifisch durch den Filter für Texas Red sichtbar gemacht werden kann, indem die 1321-Hybridisierung durch den Dreifachbandfilter betrachtet wird. Wir können Signale für diese beiden Chromosomen unterscheiden.Das grüne Signal entspricht Chromosom 13 und kann spezifisch mit dem Einzelbandfilter für FITC visualisiert werden. Mit dem Einzelbandfilter für Texas Red können wir die Signale für Chromosom 21 spezifisch visualisieren. Alle normalen Spermatozoen sollten jeweils ein Signal für jede dieser beiden Sonden aufweisen.Zusammenfassend hier die wichtigsten Schritte des Protokolls. Der Fixierungsprozess sollte erneut genau durchgeführt werden, um qualitativ hochwertige Ausstriche durch tropfenweise Zugabe der Methanol-Essigsäure-Lösung zu erhalten. Um die Bildung von Spermienaggregaten während des Dekondensationsprozesses zu vermeiden, muss die Inkubationszeit in der DTT-Lösung je nach Reaktivität der Spermaprobe gegenüber diesem Produkt angepasst werden.Eine übermäßige Exposition der Spermatozoen gegenüber DTT würde am Ende des Protokolls zu verstreuten Signalen führen, während eine unzureichende Exposition zu keiner Sondehybridisierung und einem Fehlen einiger Signale führen würde. Während die Denaturierung der Spermaprobe zwingend erforderlich ist, muss die Denaturierung der Sonde den Herstellerangaben angepasst werden. Es ist wichtig, die Dauer und Temperatur der beiden nach der Hybridisierung durchgeführten Waschschritte streng zu kontrollieren.Eine höhere Temperatur oder eine zu lange Waschdauer kann dazu führen, dass einige Signale verloren gehen, während umgekehrt unspezifische Signale nicht eliminiert würden. Schließlich ist die Verwendung eines Epi-Fluoreszenzmikroskops, das mit geeigneten spezifischen Filtern ausgestattet ist, entscheidend für eine gute Visualisierung und Signalinterpretation. Und das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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