Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Das Protokoll zur Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in menschlichen Spermakernen wurde in der klinischen Diagnostik weitgehend etabliert. Eine Anwendung dieser Methodik ist die Ploidie-Screening von Spermatozoen. Im Rahmen der Beratung bei Unfruchtbarkeit bei Männern ist das Vorkommen numerischer Aberrationen bei diesen Individuen höher als in der Gesamtbevölkerung, und sie weisen häufig abnorme Samenparameter auf.

Dies stellt ein erhöhtes Risiko dar, diese Anomalien an Nachkommen weiterzugeben. Heute werden wir die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nach Dekondensation der Spermienkerne zur Analyse der Chromosomen 13, 18, 21, X und Y veranschaulichen. Sobald die Probe gesammelt wurde, sollte sie bis zur Verflüssigung 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Um mit dem Protokoll zu beginnen, muss die Probe in ein Zentrifugenröhrchen überführt werden.

Die Lösungen, die wir im ersten Teil des Experiments verwenden, sind hypertonisch, auf 37 Grad C vorgewärmt und bestehen aus Methanol und Essigsäure im Verhältnis drei zu eins. Diese müssen frisch hergestellt werden. Anschließend ist die Probe bereit, fünf Minuten lang mit tausend G zu zentrifugieren.

Entfernen Sie nun vorsichtig den Überstand und geben Sie die hypertonische Lösung Tropfen für Tropfen hinzu, bis ein Volumen von etwa 10 Milliliter erreicht ist. Dieses Reagenzglas muss 30 Minuten lang bei 37 Grad C verbleiben, anschließend muss die Probe erneut zentrifugiert werden. Durch die Zentrifugation sammeln sich die Spermatozoen am Boden des Reagenzglases, wodurch wir die hypotonische Lösung durch Methanol ersetzen können.

Die Essigsäure-Zentrifugation muss so oft wiederholt werden, wie nötig, um die Methanol-Essigsäure-Lösung mehrmals auszuwechseln, bis ein weißes Pellet erhalten wird. Sobald dies der Fall ist, muss frische Methanol-Essigsäure-Lösung hinzugefügt werden. Das Endvolumen sollte entsprechend der gewünschten Zellverteilung bei nachfolgenden Schritten angepasst werden.

Der letzte Schritt besteht darin, die Ausstriche herzustellen, indem die fixierte Probe auf Reed-Objektträger, die in Methanol bei minus 20 Grad C aufbewahrt werden, abgetropft wird. Es ist hilfreich, den Bereich des Objektträgers, der die Spermienausstriche enthält, für zukünftige Lokalisierungen zu markieren. Dies kann mithilfe eines Diamantstifts auf der Rückseite des Objektträgers leicht durchgeführt werden. Sobald eine optimale zelluläre Verteilung bestätigt wurde, sollten die Objektträger mindestens 24 Stunden lang bei minus 20 Grad C gelagert werden.

Bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren. In diesem Teil des Experiments werden wir Salzlösung, Natriumcitratlösung, eine Ethanolreihe, DRE, fatales und fides verwenden. Nachdem die Objektträger aufgetaut wurden, müssen die fixierten Proben gewaschen und durch Eintauchen in zwei aufeinanderfolgende Coplin-Flaschen, die jeweils zweifache SSC enthalten, dehydriert werden.

Dies dauert drei Minuten für jeden Coplan. Anschließend müssen die Objektträger in der Reihenfolge steigender Konzentration jeweils zwei Minuten lang in die Ethanol-Coplan-Gefäße getaucht werden. Zu diesem Zeitpunkt müssen die Objektträger getrocknet werden, um mit den folgenden Schritten fortzufahren.

Da die DNA im Spermiumkern stark kompaktiert ist, muss das Chromatin vor der Denaturierung entfaltet werden. Dies kann mit einer DTT-Lösung bei 37 Grad C durchgeführt werden. Dieses Produkt wirkt, indem es die Disulfidbrücken des Protamins spaltet, das die DNA im Kern der Spermatozoen umwickelt. Die Inkubationszeit des Objektträgers in DTT muss je nach Reaktivität der Spermaprobe gegenüber diesem Produkt angepasst werden.

In der Regel dauert dies etwa acht Minuten, kann jedoch zwischen zwei und 15 Minuten variieren. Nach dieser Zeit müssen die Objektträger sofort zweimal für jeweils drei Minuten in 2× SSC überführt werden, gefolgt von jeweils zwei Minuten in jedem der Ethanol-Coplan-Gläser. Für die Sondenhybridisierung ist es unerlässlich, mit einzelsträngigen DNA-Strängen zu arbeiten. Dies erfordert eine Denaturierungsstufe vor der Zugabe der Sonden, die eine Inkubationszeit von fünf Minuten in einer Formamidlösung bei 73 °C umfasst. Zum Abschluss der Objektträgerbehandlung ist eine letzte Überführung in die Ethanol-Lösung erforderlich, wobei die Objektträger je Coplan-Glas für eine Minute eingetaucht werden.

Die Objektträger sind anschließend bereit, in FISH-Analysen verwendet zu werden, die für die klinische Diagnostik durchgeführt werden. Zu den am häufigsten untersuchten Chromosomen gehören die Geschlechtschromosomen sowie die Chromosomen 13, 18 und 21. Zur Analyse dieser Chromosomen verwenden wir ein mehrfarbiges DNA-Sonden-Kit von vices.

Dieses enthält ein Röhrchen mit einer Sondenkombination für die Alpha-Satellitenregion der Chromosomen X, Y und 18, die jeweils grün und aqua markiert sind, sowie ein weiteres Röhrchen mit einer Kombination von Sonden für die Chromosomen 13 und 21, die jeweils grün und orange markiert sind. Die Menge der hinzugefügten Sondenmischung variiert je nach Größe des Hybridisierungsbereichs als Referenz für ein Deckglas von 15 mal 15. Ein Volumen von fünf Mikrolitern ist ausreichend.

Beide Sondenmischungen werden zur vereinfachten Handhabung vorab in einem Hybridisierungspuffer denaturiert, sodass sie direkt zu den dekondensierten und denaturierten Objektträgern hinzugefügt werden können. Es sind außerdem andere kommerzielle Sonden für eine breite Palette von Chromosomen und Loki erhältlich, die in diesen Experimenten verwendet werden können. Gewöhnlich erfordern diese Sonden jedoch eine Vorbehandlung zur Denaturierung, bevor die Mischung zur Zielprobe gegeben wird.

In diesen Situationen genügt es, den Herstelleranweisungen zu folgen. Der Zielbereich muss mit einem Deckglas abgedeckt und mit Kautschukzement versiegelt werden. Anschließend werden die Objektträger in die Hybridisierungskammer gegeben, die vorab auf 37 Grad C vorgewärmt wurde, und sechs bis 24 Stunden bei dieser Temperatur inkubiert.

Im letzten Teil des Protokolls verwenden wir diese beiden Waschlösungen, die aus unterschiedlichen Konzentrationen von Salin-Natrium-Citrat-Lösung und dem Tensid NP 40 bestehen. Nach der Inkubationszeit können die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entfernt werden, um den Gummizement zu beseitigen. Anschließend wird vorsichtig der Deckglaser entfernt.

Wie gezeigt, werden die Objektträger zwei Minuten lang in die erste Waschlösung, die auf 73 °C vorgewärmt wurde, getaucht. Anschließend werden sie für eine weitere Minute in die zweite Waschlösung bei Raumtemperatur überführt. Diese beiden Waschschritte helfen uns, unspezifische Hybridisierungssignale zu eliminieren. Nach diesen beiden Waschungen müssen wir warten, bis die Objektträger vollständig getrocknet sind, um den letzten Schritt des Protokolls abzuschließen.

An dieser Stelle wird ein Gegenfärbemittel hinzugefügt, um die Visualisierung des Zellkerns zu erleichtern. Eines der gebräuchlichsten Produkte für diesen Zweck ist dpi. Die zugegebene Menge muss ebenfalls an die Größe des hybridisierten Bereichs angepasst werden, wobei eine Deckglasgröße von 18 mal 18 als Referenz dient.

Ein Volumen von acht Mikrolitern DPI ist ausreichend. Der Deckel kann mit Nagellack versiegelt werden, und nun sind die Präparationen zur Visualisierung bereit. Alternativ können sie bis zur späteren Analyse bei minus 20 Grad C gelagert werden.

Das Mikroskop, das wir für die Visualisierung verwenden werden, ist ein Olympus BX 60 Epi-Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem Dreifach-Bandfilter für DAPI, Texas Red und FITC sowie Einzelbandfiltern für Aqua-FITC und Texas Red. Durch den Dreifach-Bandfilter erscheinen die Präparate, die mit x, Y und 18 hybridisiert wurden, als Signale für diese drei Chromosomen. Mithilfe des Einzelbandfilters für Aqua können wir ausschließlich die fluoreszierenden Signale für Chromosom 18 visualisieren. In jedem normalen Spermatozoon sollte eines dieser Signale zu erwarten sein.

Bei Verwendung des Einzelbandfilters jedoch ausschließlich für FITC zeigen einige Spermatozoen ein fluoreszierendes grünes Signal, das dem X-Chromosom entspricht. Die Spermatozoen, die das grüne Signal fehlt, sollten ein rotes Signal für das Y-Chromosom aufweisen, das spezifisch durch den Filter für Texas Red sichtbar gemacht werden kann, indem die 1321-Hybridisierung durch den Dreifachbandfilter betrachtet wird. Wir können Signale für diese beiden Chromosomen unterscheiden.

Das grüne Signal entspricht Chromosom 13 und kann spezifisch mit dem Einzelbandfilter für FITC visualisiert werden. Mit dem Einzelbandfilter für Texas Red können wir die Signale für Chromosom 21 spezifisch visualisieren. Alle normalen Spermatozoen sollten jeweils ein Signal für jede dieser beiden Sonden aufweisen.

Zusammenfassend hier die wichtigsten Schritte des Protokolls. Der Fixierungsprozess sollte erneut genau durchgeführt werden, um qualitativ hochwertige Ausstriche durch tropfenweise Zugabe der Methanol-Essigsäure-Lösung zu erhalten. Um die Bildung von Spermienaggregaten während des Dekondensationsprozesses zu vermeiden, muss die Inkubationszeit in der DTT-Lösung je nach Reaktivität der Spermaprobe gegenüber diesem Produkt angepasst werden.

Eine übermäßige Exposition der Spermatozoen gegenüber DTT würde am Ende des Protokolls zu verstreuten Signalen führen, während eine unzureichende Exposition zu keiner Sondehybridisierung und einem Fehlen einiger Signale führen würde. Während die Denaturierung der Spermaprobe zwingend erforderlich ist, muss die Denaturierung der Sonde den Herstellerangaben angepasst werden. Es ist wichtig, die Dauer und Temperatur der beiden nach der Hybridisierung durchgeführten Waschschritte streng zu kontrollieren.

Eine höhere Temperatur oder eine zu lange Waschdauer kann dazu führen, dass einige Signale verloren gehen, während umgekehrt unspezifische Signale nicht eliminiert würden. Schließlich ist die Verwendung eines Epi-Fluoreszenzmikroskops, das mit geeigneten spezifischen Filtern ausgestattet ist, entscheidend für eine gute Visualisierung und Signalinterpretation. Und das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.