Name: Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Lernen Sie die hochgradige Reinigung von Toxoplasma gondii-Oozysten aus Katzenkot mittels diskontinuierlichem Cäsiumchlorid-Gradienten. Diese Methode liefert reine Präparate für molekularbiologische und Gewebekultur-Experimente.

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Wir möchten Nichole Brinkman und Michael Ware für technische Durchsicht des Manuskripts und Dr. Abu Sayed und Linda Ransick für technische und administrative Unterstützung zu danken. Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung teilweise finanziert und arbeitete in der hier beschriebenen Untersuchungen unter Vertrag Anzahl EP-D-06 bis 096 zu Dynamac, Inc. und eine ressortübergreifende Einigung Anzahl DW-12-92289801-0 bis USDA. Es ist zu überprüfen Agentur unterzogen und zur Veröffentlichung freigegeben. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung für den Einsatz. MJS aktuelle Adresse: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

<p class="jove_title"&gt; 1 ist. Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Es ist wichtig, alle Sicherheitsvorkehrungen zu folgen, wenn die Arbeit mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten. In den meisten gesunden Menschen,<em&gt; T. gondii</em&gt; Infektion ist leicht durch das Immunsystem kontrolliert, aber ein Leben lang Infektion führt. Immungeschwächten Personen sind besonders anfällig für Toxoplasmose und sollte nicht mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten. Schwangere Frauen sollten auch nicht mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten, weil Infektion schwerer Geburtsfehler verursachen kann,<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten sollten nur in einem bestimmten Bereich und mit geschultem Personal gehandhabt werden. Hinweisschilder<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocyst Arbeit ist im Gange sind geschrieben, andere in die vorgesehenen Bereich aufmerksam zu machen.</li&gt;<li&gt; Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie Laborkittel, Einweg-Kittel, Einweghandschuhe und angemessenen Augenschutz bzw. Gesichtsschutz beim Umgang mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten.</li&gt;<li&gt; Häufige Handschuh Änderungen empfohlen. Fassen Sie alle Laborgeräte mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oocyst Handschuhen kontaminiert.</li&gt;<li&gt; Immer Metall autoklavierbar Tabletts mit einer Einwegabsorptionsartikel Liner ausgekleidet bei der Arbeit mit<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten. Sicherstellen, dass alle Racks, Röhren, etc. verwendet werden entweder Einweg-oder autoklavierbar.</li&gt;<li&gt; Alle<em&gt; T. gondii</em&gt; Abfälle müssen zweimal für mindestens eine Stunde autoklaviert werden.</li&gt;<li&gt; Alle Nicht-Einweg-Geräte (Racks, Schalen, etc.) müssen ebenfalls zweimal für mindestens eine Stunde autoklaviert werden.</li&gt;<li&gt; Vakuum-Leitungen verwendet werden, um Flüssigkeiten absaugen sollte zu einer Vacushield ™-Filter verbunden werden, um eine Kontamination der Vakuumpumpe zu verhindern.</li&gt;<li&gt; Alle betroffenen Labortisch-Tops muss nach Abschluss der Arbeiten mit desinfiziert werden<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten. Frisch aus 10% Hypochlorit sollte großzügig auf die Arbeitsfläche aufgetragen werden und erlaubt trocken. Die Fläche muss dann gut mit Wasser abgespült werden.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Herstellung der Puffer und Lösungen</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Bereiten Sie einen 1 L 2,2 M Lösung von Saccharose durch Auflösen von 752,66 g Saccharose in 600 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Umrühren und Hitze vorsichtig mit einem beheizten Rührplatte der Saccharose aufzulösen. Einmal vollständig gelöst, bringen Volumen auf 1 l mit ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Dies sollte durch die Sterilisation im Autoklaven die Lösung für mindestens 20 Minuten eingehalten werden.</li&gt;<li&gt; Bereiten Sie eine 1L TE-Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 durch Zugabe von 6,05 g Tris-HCl und 3,7 g EDTA in 700 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O, pH-Wert einstellen auf 7,2 dann bringen Volumen auf 1 l mit ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Für die CsCl-Gradienten, bereiten eine Stammlösung von CsCl mit einem spezifischen Gewicht von 1,15 (1,15-CsCl), indem 21,75 g CsCl mit 103,25 ml TE-Puffer. Für Lösung A, mix 30 ml TE mit 20 ml 1.15-CsCl. Für Lösung B, Mix 20 ml TE mit 30 ml 1.15-CsCl und 12,5 ul Phenol rote Lösung. Für die Lösung C, Mischung von 10 ml TE mit 40 ml 1.15-CsCl (Tabelle 1).</li&gt;<li&gt; Bereiten Sie eine 1L 1 N Lösung von Natriumhydroxid (NaOH) durch Auflösen von 40 g NaOH, in 800 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Nach der Auflösung bringen Volumen auf 1 l mit ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;<li&gt; Bereiten Sie einen 1 L 2% (nach Volumen) Lösung von H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mischen von 20 ml H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Mit 980 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Sucrose float</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 10 ml einer fäkalen Aussetzung der<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten, in 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, In einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Anzumerken ist, dass fäkale Suspension Proben wurden durch eine Saccharose Flotation Verfahren wie zuvor beschrieben vorverarbeitet bezieht sein<sup&gt; 8</sup&gt;. Wenn der Stuhlproben zunächst aus dem infizierten Katzen geerntet werden sie durch eine Saccharose-Float in Bezug 8 beschrieben verarbeitet. Diese zusätzliche Saccharose float ist notwendig, um weiter zu minimieren fäkale Verunreinigungen über die CsCl Reinigungsprozess durchgeführt und erhalten die reinste<em&gt; T. gondii</em&gt; Oozysten möglich.</li&gt;<li&gt; Neutralisieren die 2%-H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; Durch Zugabe von 6 ml (5.3-Volumes) von 1 N NaOH auf die fäkale Suspension. Gut mischen durch Vortexen.</li&gt;<li&gt; Add gleichem Volumen (16 ml) von 2,2 M Saccharose Erstellung einer Endkonzentration von 1,1 M auf die fäkale Federung und gut mischen durch Vortexen.</li&gt;<li&gt; Vorsichtig überlagern die Saccharose / fäkal Suspension mit 10 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O mit einer 10 ml Pipette. Die Suspension bei 1.200 xg für 20 min bei Raumtemperatur ohne Bremse.</li&gt;<li&gt; Sorgfältig sammeln top Wasser und Interphase Schichten und an einem neuen 50 ml konische Zentrifugenröhrchen durch Pipettieren aus der Luft-Wasser-Grenzfläche ohne Verwirbelung der Pipette. Es ist wichtig, Saccharose Verschleppung zu minimieren, während das Sammeln der Interphase-Schicht.</li&gt;<li&gt; Mix die restlichen Saccharose / fäkal Pellet-Lösung durch Vortexen der Röhre.</li&gt;<li&gt; Wiederholen Sie die Schritte 3,4 und 3,5.</li&gt;<li&gt; Bringen Sie die Lautstärke der beiden oocyst Interphase-Lösungen auf 50 ml mit ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O und zentrifugieren bei 2.000 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li&gt;<li&gt; Den Überstand aspirieren aus und die Dynabeads Pellets mit 5 ml TE-Puffer und Pool der Oozysten Federung zusammen. Der gesamte Pool-Volumen sollte 10 ml werden.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl-Gradienten</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Bereiten Sie einen diskontinuierlichen CsCl-Gradienten in einer 50 ml Polycarbonat Oak Ridge Röhrchen durch vorsichtiges Unterlegen jede Schicht mit einer 50 ml Spritze mit einer 18-Gauge-blunt-ended, autoklavierbar, Stahlnadel und einem 2-Wege-Hahn. Hinweis: Phenolrot ist die Lösung B hinzugefügt, um leicht zwischen den Gradienten-Schichten (Tabelle 1) zu unterscheiden.</li&gt;<li&gt; Langsam fügen Sie die folgenden Lösungen für das Rohr in der angegebenen Reihenfolge. Es wird darauf hingewiesen, dass die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht mehr als 0,5 ml / sec werden.<ol&gt;<li&gt; 10 ml des TE / oocyst Suspensionsprobe</li&gt;<li&gt; 8 ml Lösung A</li&gt;<li&gt; 8 ml Lösung B</li&gt;<li&gt; 8 ml Lösung C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; Centrifuge die Oak Ridge Röhrchen bei 12.000 xg für 60 min bei 4 ° C ohne Bremse. Die Verwendung eines Festwinkelrotor ist akzeptabel, aber mit hoher Geschwindigkeit Ausschwingrotor führt zu einer besseren Trennung der Oozysten aus der Suspension Probe mit minimalem fäkale Verunreinigungen Abstriche an der Seite oder das Rohr. Das Ausmaß der Abstriche hängt von der Zusammensetzung der fäkalen Suspension und damit kann es erforderlich sein, um zwei CsCl-Gradienten durchzuführen, wenn die fäkale Federung ist extrem verschmutzt.</li&gt;<li&gt; Nach der Zentrifugation sammeln die opaken / weiß Oozysten mit Band zwischen Lösungen A und B. Um eine Kontamination mit fäkalen Verunreinigungen zu minimieren, gehen Sie direkt auf die Oozysten Band, ohne die Steigung und sammeln die Oozysten Interphase mit einer 10 ml Pipette. Übertragen Sie die Oozysten Interphase in ein neues 50 ml konische Zentrifugenröhrchen. Versuchen Sie, die Höhe der CsCl-Lösung abgesaugt minimieren, während das Sammeln der Oocysten Interphase, wie es ein Problem in Pelletierung der Oozysten in den Waschschritt darstellen können.</li&gt;<li&gt; Wash Oozysten mit 30-40 ml ddH<sub&gt; 2</sub&gt; O. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.000 xg bei Raumtemperatur für 10 min ohne Bremse. Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Oozysten Pellet. Wiederholen Sie die Wäsche zusätzlich 2 mal.</li&gt;<li&gt; Am Ende der letzten Waschen sorgfältig absaugen der Überstand und das Pellet in 10 ml 2% iger Schwefelsäure und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. Oozysten sind nun bereit zur weiteren Bearbeitung. Oozysten Reinheit kann mikroskopisch durch das Fehlen von fäkalen Verunreinigungen in der Probe überprüft werden.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
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<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

gewinnung von hochgradig gereinigter toxoplasma gondii oocysten durch eine diskontinuierliche cäsiumchloridgradienten

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulären Protozoen Erreger, die häufig Menschen infiziert. Es ist ein gut charakterisierter apicomplexan mit verursacht durch Lebensmittel und Wasser übertragene Seuchen verbunden. Der Endwirt ist die Katze Arten, bei denen sexuelle Replikation in der Entwicklung der hoch ansteckenden und umweltfreundlich beständig oocyst was geschieht. Die Infektion erfolgt über die Aufnahme von Zysten aus kontaminiertem Fleisch oder Oozysten aus dem Boden oder Wasser. Die Infektion erfolgt in der Regel asymptomatisch in gesunden Personen, aber die Ergebnisse in eine lebenslange latente Infektion, die Reaktivierung verursachen Toxoplasmose-Enzephalitis und Tod, wenn das Individuum wird immungeschwächten können. Fleisch mit T. kontaminierte gondii Zysten haben die primäre Quelle der Infektion in Europa und den Vereinigten Staaten, aber die jüngsten Veränderungen in der Tierhaltung und Tierhaltung und verbessert den Umgang mit Lebensmitteln und Verarbeitungsverfahren haben wesentlich die Prävalenz von T. reduziert gondii Zysten in Fleisch 1, 2. Dennoch bleibt Seroprävalenz beim Menschen relativ hohe darauf hindeutet, dass Exposition von Oozysten kontaminierten Boden oder Wasser auftreten. In der Tat haben auf Wasserbasis Ausbrüche von Toxoplasmose gemeldet weltweit unterstützen die Theorie der Exposition gegenüber der Umwelt oocyst Form stellt eine erhebliche Gesundheitsgefährdung 3-5. Bis heute Forschung zum Verständnis der Prävalenz von T. gondii Oozysten im Wasser und Umwelt sind durch den Mangel an Tools, um Oozysten in der Umwelt 5, 6 erkennen begrenzt. Dies ist vor allem auf den Mangel an effizienten Reinigung Protokolle für die Gewinnung einer großen Anzahl von hochreinem T gondii Oozysten aus infizierten Katzen zu Forschungszwecken. Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines modifizierten CsCl-Methode, die leicht reinigt T. gondii Oozysten aus Kot von infizierten Katzen, die sich für molekularbiologische und Gewebekulturen Manipulation 7 sind.

Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines modifizierten CsCl-Methode, die leicht reinigt T. gondii Oozysten aus Kot von infizierten Katzen, die geeignet sind für molekularbiologische und Gewebekulturen Manipulation

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulärer protozoischer Pathogen, der häufig Menschen infiziert. Es handelt sich um einen gut charakterisierten Apicomplexa, der mit ... assoziiert ist.

Toxoplasma Goia Osis werden typischerweise aus infiziertem Katzenkot gewonnen und mittels einer Schwimmmethode isoliert, wodurch eine teilweise gereinigte Suspension entsteht, die für molekulare Untersuchungen und Zellkulturen geeignet ist. Experimente an diesem Parasiten erfordern jedoch hochgereinigte Osis, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die weitergehende Reinigung der Osis erfolgt über einen Saccharose-Schwimmschritt, bei dem die Osis resuspendiert und mit Saccharose bedeckt werden, anschließend mit Wasser überschichtet und zentrifugiert werden, um die Osis von dem Großteil des Fäkalmaterials zu trennen.Die Osis-Schicht wird anschließend in ein neues Röhrchen übertragen, das mit Cäsiumchlorid unterlegt ist, und zentrifugiert. Das resultierende deutliche OSIS-Band wird dann gesammelt und gewaschen, um für Experimente verwendbar zu sein, die hochreines Teon io zur Unterstützung benötigen. Hallo, ich bin Dr. Sarah Staggs, Angestellte von Dynam, einem Auftragnehmer des National Exposure Research Laboratory der US-amerikanischen Umweltschutzbehörde.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Reinigung von Toxoplasma Gandhi io Oasis aus dem Kot laborinfizierter Katzen mithilfe eines diskontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten. Dieses Verfahren wird in unserem Labor routinemäßig zur Isolierung von OSI eingesetzt, um die Verwendung in Molekularbiologie- und Zellkultur-Experimenten zu ermöglichen. Beginnen wir also.Bevor mit TG O Osis gearbeitet wird, sollten wichtige Sicherheitsaspekte berücksichtigt werden. Personen, die immungeschwächt sind, schwanger sind oder aktiv versuchen, schwanger zu werden, sollten den Erreger aufgrund des Risikos, eine Toxoplasmose zu erwerben, nicht handhaben, da diese Erkrankungen und schwere Geburtsfehler verursachen kann. X. Um das Infektionsrisiko zu verringern, sollte ein bestimmter Bereich für dieses Verfahren reserviert und Schilder angebracht werden, um andere zu warnen, bevor sie den Raum betreten.Denken Sie daran, beim Umgang mit T-One-IO-Zysten einen Laborkittel, einen Einweg-Schutzanzug, Einweghandschuhe sowie geeigneten Augenschutz oder einen Gesichtsschutz zu tragen. Wechseln Sie die Handschuhe regelmäßig und vermeiden Sie es, Geräte mit kontaminierten Handschuhen zu berühren. Arbeiten Sie außerdem auf metallenen, autoklavierbaren Tabletts, die mit Einweg-Absorptionsunterlagen ausgelegt sind. Und in diesem Zusammenhang nehmen Sie sich eine Minute Zeit, um sicherzustellen, dass alle Rack, Röhrchen und sonstigen Geräte, die Sie verwenden möchten, entweder Einwegartikel oder autoklavierbar sind. Wenn Sie Artikel, die nicht für den Einmalgebrauch bestimmt sind, verwenden, müssen Sie diese nach der Nutzung zwei Stunden lang in zwei einstündigen Zyklen autoklavieren. Außerdem sollten Sie alle Vakuumleitungen an ein Vakuumabscheidefilter anschließen, um eine Kontamination der Vakuumpumpe zu vermeiden.Wenn Sie mit der Isolierung der Zysten fertig sind, müssen Sie eine frische 10 %ige Hypochloritlösung auf Ihre Arbeitsfläche auftragen. Lassen Sie sie trocknen und spülen Sie die Fläche anschließend mehrmals mit Wasser ab. Sobald die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen wurden, können Sie mit Ihren Experimenten fortfahren.Bevor die T Guni OYS-Sammlung erfolgt, müssen zunächst alle notwendigen Lösungen für den Saccharose-, Schwimm- und Cäsiumchlorid-Gradienten vorbereitet werden. Zentrifugationsschritte. Die benötigten Lösungen umfassen eine 2,2 molare Saccharoselösung, die durch einen 20-minütigen Zyklus im Autoklaven sterilisiert wurde, ein Liter TE-Puffer mit pH 7,2, eine einnormalen Lösung Natriumhydroxid, eine 2%-ige Lösung Schwefelsäure und eine Stammlösung von Cäsiumchlorid mit einer Dichte von 1,15.Die 1,15 Cäsiumchlorid-Stammlösung wird verwendet, um die Lösungen A, B und C herzustellen, die zur Herstellung des Cäsiumchlorid-Gradienten benötigt werden. Lösung A wird hergestellt, indem 30 Milliliter TE mit 20 Millilitern der 1,15 Cäsiumchlorid-Stammlösung gemischt werden; Lösung B wird hergestellt, indem 20 Milliliter TE mit 30 Millilitern der 1,15 Cäsiumchlorid-Stammlösung gemischt und anschließend 12,5 Mikroliter Pheno-Rot-Lösung zugegeben werden. Schließlich wird Lösung C hergestellt, indem 10 Milliliter TE mit 40 Millilitern der 1,15 Cäsiumchlorid-Lösung gemischt werden.Wir beginnen die Herstellung der Saccharose-Dichtegradientenlösung, indem wir eine 10-Milliliter-Fäkalien-Suspension von T osis in 2 % Schwefelsäure hernehmen und in ein 50-Milliliter-kegelförmiges Zentrifugenröhrchen überführen. Die Fäkalien stammen von infizierten Katzen und wurden zuvor bereits gemäß einem in einem Lehrbuch von Dr. JP Duby mit dem Titel Toxoplasmosis of Animals and Humans beschriebenen Saccharose-Flotationsverfahren aufgearbeitet. Dieser zusätzliche Schritt reduziert die Menge an Fäkalschmutz im Cäsiumchlorid-Reinigungsverfahren weiter und trägt dazu bei, die höchste Reinheit der T goi-Zysten zu erzielen.Anschließend neutralisieren wir die Schwefelsäure, indem wir drei Fünftel des Volumens einer einnormalen Natriumhydroxidlösung zur Stuhl-Suspension hinzufügen. Die Suspension wird gründlich durch Wirbelmischen homogenisiert. Danach wird ein gleiches Volumen Saccharose zugegeben und die Suspension erneut gründlich durch Wirbelmischen vermischt.Unter Verwendung von 10 Milliliter pro Gefäß vorsichtig die Saccharose-Fäkal-Suspension mit 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser überlagern. Nach sorgfältiger Durchführung die Röhrchen in die Zentrifuge geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 1200 × g zentrifugieren, ohne nach dem Zentrifugieren abzubremsen. Vorsichtig, ohne die Grenzfläche zwischen Luft und Wasser zu stören, langsam die Pipette von der Luft-Wasser-Grenzfläche aus bewegen, um die oberste wässrige Schicht und die Grenzflächenschicht zu sammeln.Es ist sehr wichtig, die Menge der Saccharoselösung, die beim Sammeln der Grenzflächenschicht übertragen wird, so gering wie möglich zu halten. Überführen Sie diese Schichten in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Vortexen Sie das Röhrchen, um die verbleibende Saccharose-Fäkalien-Pellet-Lösung zu mischen.Wiederholen Sie die vorherige Wasserüberlagerung in den Zentrifugationsschritten noch einmal. Sammeln Sie nach dem Zentrifugieren die oberen wässrigen und Grenzflächenschichten und überführen Sie sie in ein neues Gefäß. Verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser, um das Volumen der beiden Cystus-Grenzflächenlösungen auf 50 Milliliter aufzufüllen.Anschließend die Röhrchen 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2000 × g zentrifugieren. Abschließend den überstehenden S-Überstand von jedem Röhrchen abpipettieren. Die Pellets in fünf Milliliter TE-Puffer resuspendieren und die Osmose-Suspensionen aufziehen.Die Osis sind nun bereit für den Cäsiumchlorid-Gradientenschritt. Wir beginnen damit, einen diskontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten in einem 50-Milliliter-Polycarbonat-Oak-Ridge-Röhrchen herzustellen. Geben Sie 10 Milliliter der Suspension, die TE und Osis enthält, mithilfe einer 50-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen, autoklavierbaren Stahlnadel mit 18 Gauge in das Polycarbonat-Röhrchen.Und über einen zweifach wirkenden Stopfen langsam die folgenden Lösungen direkt auf den Boden des Reagenzglases geben. Acht Milliliter Lösung A, acht Milliliter Lösung B und acht Milliliter Lösung C. Stellen Sie sicher, dass die Fließgeschwindigkeit 0,5 Milliliter pro Sekunde nicht überschreitet. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass das Phenolrot in Lösung B hilft, die Gradientenschichten zu unterscheiden.Jetzt können Sie das Oak-Ridge-Röhrchen bei 12.000 × g für 60 Minuten bei vier Grad Celsius ohne Bremse mit einem festen Winkel-Rotor mit hoher Geschwindigkeit zentrifugieren. Nach Abschluss der Zentrifugation sammeln wir den trüben weißen Ring zwischen den Lösungen A und B. Dieser Ring enthält die Oocysten. Mit einer 10-Milliliter-Pipette gehen Sie direkt zur Oocysten-Schicht, ohne das Gradientenprofil zu stören, und sammeln die Oocysten.Versuchen Sie, die Menge an Cäsiumchloridlösung, die Sie beim Sammeln der Zysten ansaugen, zu minimieren, da überschüssiges Cäsiumchlorid es erschweren könnte, die Zysten während der Wäsche zu pelletieren. Im späteren Schritt überführen Sie das OSIS in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die O-Zysten nun mit 30 bis 40 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand, wobei Sie darauf achten, das Pellet der O-Zysten nicht aufzulösen.Wiederholen Sie die Waschung noch zweimal. Sobald die letzten Waschungen abgeschlossen sind, aspirationsieren Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren das Pellet in 10 Milliliter 2 % Schwefelsäure. Überprüfen Sie den OSIS unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle fäkalen Rückstände erfolgreich aus der Probe entfernt wurden.Die Osis sind nun bereit für weitere Bearbeitung, oder Sie können sie bei vier Grad Celsius lagern, bis Sie sie verwenden möchten. Hier sehen Sie, wie unreine Osis unter einem differentiellen Interferenzkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung aussehen. Beachten Sie das Vorhandensein großer Mengen fäkaler Verunreinigungen im Bildfeld, wodurch es sehr schwierig ist, die OSI-Assists zu identifizieren.Hier sehen Sie, wie die OISS nach der Reinigung über einen Cäsiumchlorid-Gradienten bei 400× aussehen. Beachten Sie das Fehlen von fäkalen Rückständen. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Toxoplasma gondii aus dem Kot laborinfizierter Katzen mittels eines diskontinuierlichen Cäsiumchlorid-Gradienten reinigt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Sicherheitsrichtlinien zu beachten und stets vorsichtig zu sein, wenn die Cäsiumchlorid-Dichte-Gradienten durch langsames Hinzufügen jeder Schicht unterlaufen werden, wobei darauf geachtet werden sollte, den Gradienten nicht zu stören oder zu vermischen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

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Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.

Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Lernen Sie die hochgradige Reinigung von Toxoplasma gondii-Oozysten aus Katzenkot mittels diskontinuierlichem Cäsiumchlorid-Gradienten. Diese Methode liefert reine Präparate für molekularbiologische und Gewebekultur-Experimente.

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

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