Name: Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Ableitung primordialer Keimzellen aus Maus-Embryonen bei 10,5 bis 11,5 Tagen post coitum. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zur Keimzellentwicklung mit Relevanz für Krebs- und Infertilitätsforschung.

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Die Autoren möchten die unschätzbare Hilfe zu bestätigen: Dr. Neal First und Kourtney Wilkinson für Manuskript-Bearbeitung; Dr. Lucy Senter, Dr. Brigit Willeford und Mike Basett für die Unterstützung bei Ausbildung und Pflege der Tiere an der MSU ALAC akkreditierten Maus-Anlage, Dr. Dwayne Wise für seine Unterstützung bei der Mikroskopie und Bilderfassung; Cesar Monroy, Hannah Swoope und Bobbie Huddleston für ihre Unterstützung mit Video-Produktion an der MSU. Diese Arbeit wurde vom Office of Institutional Research und dem Department of Biological Sciences an der Mississippi State University gefördert.

Teil 1: Schwangere Maus Laparotomie <ol><li> Mit Genickbruch, euthanize eine schwangere C57BL6J weiblichen Maus bei 10,5-11,5 dpc. </li><li> Reinigen Sie den Bauch mit antimikrobieller Seife, und dann rasieren sie. </li><li> Nach der Rasur, waschen den Bauch mit einer Kochsalzlösung. </li><li> Dann trocknen die Bauchhöhle mit einer sterilen Gaze. </li><li> Decken Sie die Maus mit einem neuen sterilen Bereich. </li><li> Machen Sie eine ventrale Inzision mit einer Pinzette und Schere Dissektion. </li><li> Und entfernen Sie die gesamte Gebärmutter aus der Bauchhöhle. Maus-Embryonen wird sichtbar in der Gebärmutter. </li><li> Übertragen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale mit D-PBS gefüllt, und bewahren Sie sie auf Eis. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell und Pinzette, entfernen Sie die Plazenta und zusätzliche embryonale Gewebe eines jeden Embryos. </li><li> Transfer-Embryonen in eine frische Petrischale mit D-PBS gefüllt. </li><li> Messen Sie die Länge der Maus-Embryonen. Wir fanden, dass die Größen nach dem Embryo das Alter unterschieden. Beispielsweise 8,5 DPC bei einem Durchschnitt von 6 mm gemessen, gemessen 10,5 dpc bei einem Durchschnitt von 11mm und 12,5 dpc bei einem Durchschnitt von 16 mm gemessen. </li><li> Dann entfernen Sie ihre Schwänze zur DNA-Extraktion. </li></ol> Teil 2: Gonadenmissbildungen Ridge Dissection Unter Stereomikroskop und Lichtquelle Schott Fostec <ol><li> Legen Sie ein Filterpapier in einer Petrischale. Legen Sie dann die Maus-Embryo auf dem Filterpapier in den Embryo trocken und unbeweglich für die Präparation. </li><li> Mit einem sterilen Skalpell, einen Schnitt quer durch die Maus-Embryo über den Ursprung der Nabelschnur. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, mit einer sterilen feinen Pinzette und einer sterilen feinen Hänseleien Nadel, entfernen Sie den Darm und Leber, so dass die Harnwege sichtbar ist. Die Nieren sind seitlich in der Bauchhöhle befindet, und die Blase befindet sich medial und kaudal im Vergleich zu den Nieren. Der Embryo kann als männlich identifiziert werden, da die Gonaden Rippen auf beiden Seiten der Blase befinden. In der weiblichen, sind die Gonaden Grate fest an der Schwanzflosse seitlichen Ende der Nieren angebracht. </li><li> Schälen Sie die Gonaden Grat aus, indem Sie eine Nadel dahinter. Die Gonaden Grat ist durch Wegschneiden der Gewebe, die es unterstützen entfernt. </li><li> Übertragen Sie die Gonaden Grate, um eine neue Petrischale mit frischem D-PBS gefüllt. Mikroskopisch, sollte die männlichen Keimdrüsen Grat werden abgestreift, groß und oval. Im Gegensatz dazu die weiblichen Keimdrüsen Grat gesichtet werden sollte, haben längliche Form und kleiner im Vergleich zu den männlichen Keimdrüsen Kamm. </li></ol> Teil 3: Gonadenmissbildungen Ridge Verdauung Unter Stereomikroskop: <ol><li> Mesonephros Dissection: Trennen Sie die Gonade aus dem Mesonephros und Rücken mit einem feinen und spitzen Nadel. <ul><li> Es ist wichtig, die Urniere aus der Gonaden Grat zu entfernen, weil es sich um eine somatische Gewebe, das in der PGC Ableitung Prozess überwuchern Wille ist. </li></ul></li><li> Gonaden Ridge Verdauung: Collect sauber Gonaden Bergrücken in einer 0.5ul Tropfen frischen D-PBS. 20 ml Collagenase / Dispase-Lösung (Endkonzentration an 1mg/ml). <ul><li> Embryonen sollten einzeln bearbeitet werden. Jeder Embryo sollte über eine eigene getrennte und beschriftet Petrischale. </li></ul></li><li> Gonaden Ridge Mincing: Schneiden Sie die Gonaden Grat in kleine Stücke mit einer sterilen Nadel und sterilen feinen Pinzette Nr. 4. </li><li> Inkubation: Petrischalen werden in einen Inkubator bei 37 übertragen ° C für 15 Minuten. <ul><li> Die Inkubationszeit kann zwischen Geweben variieren. </li></ul></li><li> Pipettieren: Nach 15 Minuten kann das Gewebe werden durch Pipettieren dissoziiert. Mit gezapftes Kapillarpipetten mit Durchmessern zwischen 40 -100 mm Break up die Stücke durch Auf-und Abpipettieren. Dies bildet kleine Klumpen. Übertragen Sie die Klumpen zu 0,5 ml einer vorher erwärmt D-PBS Drop für eine endgültige waschen. </li><li> Nach dem Waschen, übertragen Sie die Klumpen auf Eppendorf-Röhrchen. <ul><li> Nicht zu entlarven das Gewebe Kollagenase. </li><li> Machen Sie nicht einen einzigen Zellsuspension. Dies ist für die Kolonie-Bildung wichtig. Wenn es eine einzige Zellsuspension wird, neigen PGCs zu differenzieren und zu migrieren. </li><li> Dieser Vorgang sollte nicht länger als 20 Minuten, oder Ihre Zellen Lebensfähigkeit verlieren. </li></ul></li><li> Zentrifugation bei 2000 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand und das Pellet in 0,5 ml ergänzt knock out Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). </li></ol> Teil 4: Primordial Keimzellen Kultur "Sie sollten die nächsten Schritte rasch durchzuführen, um die Lebensfähigkeit der PGCs für die Isolierung und die Ableitung zu erhalten. <ol><li> 24 Stunden vor diesem Prozess sollten Sie bereiten mitotisch inaktivierten MEF-CF1 Feeder-Schicht nach dem Protokoll von Zhang J. et al 2008. <ul><li> Es werden 20 Gerichte für eine pregnant weiblichen Maus (6-8 Embryonen). </li><li> MEFs verlieren die Fähigkeit, eine Feeder-Schicht werden (Förderung von Wachstum und Differenzierung zu verhindern) nach 5-6 Passagen. </li><li> Verwenden Sie keine MEFs älter als 48 Stunden. </li></ul></li><li> Unmittelbar vor dem Ausplattieren PGCs, muss der MEF Medium langsam aus dem MEF Feeder-Schicht entfernt werden. </li><li> Dann fügen Sie 0,5 ml / well vorgewärmtes ergänzt Knockout Mediums auf die MEF Feeder-Schicht. <ul><li> MEF Medium enthält Rinderfötenserum dass eine Differenzierung der PGCs induziert. </li><li> Knockout Medium muss mit specie spezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt werden unmittelbar vor Gebrauch, um die Aktivität der wachsen-Faktor sorgen. </li></ul></li><li> Mit symmetrische Verteilung, Platte PGCs über die MEF Feeder-Schicht. <ul><li> Wenn diese Stücke zu nahe sind, neigen sie zu aggregieren und bilden dichte Kolonien, die schlecht anbringen oder beginnen differenzieren. </li><li> Kulturschalen muss mit embryonalen Germinal Zelllinie Namen, Durchgang Nummer und Datum beschriftet werden. </li></ul></li><li> Vorsichtig, überweisen Sie den Kulturschalen in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Überwachen Sie die Zellen alle 24 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden zu entfernen 250 ml von Medien aus der Spitze der Kultur nicht zu stören der Kolonie Anhang. Dann fügen Sie 250 ml frischem ergänzt Knock-out-Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). </li><li> Nach Schritt 7, warten weitere 48 Stunden, und dann vollständig zu entfernen alle Medien und ersetzen Sie es mit frischen ergänzt Knock-out-Medien (bei 37 ° C vorgewärmt). Tun Sie dies alle 2 Tage für 8-10 Tage, bis PGC Kolonien zu bilden. </li></ol> Teil 5: Embryonale Keimzellen <ol><li> Nach 10 Tagen PGC Isolation, sind embryonale Keimzelle Kolonien gebildet. </li><li> Embryonale Keimzelle Linien sind am Leben gehalten durch manuelle Passagen alle 8-10 Tage. Sie fahren fort, eine undifferenzierte Morphologie präsentieren und ausdrücken Pluripotenz Marker wie alkalyne Phosphatase, Oct-4, SSEA-1 und SOX-2 </li></ol> Hinweise <ul><li> Sterile / aseptischen Bedingungen sind unerlässlich in der Kultur Raum. </li><li> Für die Ableitung und Kultur, sind PGCs in einem Luftreiniger Class II Bio Sicherheit Kabinett verarbeitet. </li><li> Inkubationen werden in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Alle Medien und Reagenzien sind vor in einer 0,2 um Filter, Lagerung bei 4 ° C verwenden, filtriert und bei 37 vorgewärmten ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Während der Dissektion Schritte müssen alle Embryonen und Gewebe auf Eis gehalten werden. </li><li> Alle Reagenzien Flaschen werden mit Ethanol, bevor sie in einem Schrank dekontaminiert. </li><li> Verwendung von Handschuhen, Kittel und Krankenschwester caps sind Pflichtfelder. </li></ul> Abschluss Wir haben ein Video, das Ihnen zeigt, wie zu isolieren, zu leiten und Kultur embryonalen Keimzellen von Gonaden Grate 10,5-11,5 dpc Maus-Embryonen zur Verfügung gestellt. Die reproduzierbare Isolierung und langfristig Kultur der embryonalen Keimzelle Linien bietet eine entscheidende Grundlage für das Studium der frühen Embryonalentwicklung, genetischen und epigenetischen germinal Muster, Gonade Bildung, Umwelt-Auswirkungen der umliegenden Organe während des Entwicklungsprozesses der Gametogenese in der männlichen und weiblichen Embryonen, und Bestimmung der Wege, die zu Krebs und Unfruchtbarkeit führt. <img src="/files/ftp_upload/1635/1635figure1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1">

<ol><li>DeFelici, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeFelici%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A laboratory Handbook</a>. 1, Second Edition, 73-85 (1998).</li>
<li>Donovan, P. J., De Miguel, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+Germ+Cells+into+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Turning Germ Cells into Stem Cells.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).</li>
<li>Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabosky%2C+PA+%22Molecular+embryology%3A+methods+and+protocols%22">Molecular embryology: methods and protocols</a>. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).</li>
<li>Mc Laren, A., Southee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Mouse+Embryonic+Germ+Cells+into+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis.</a> Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).</li>
<li>Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+tissue+and+cell+interactions+play+key+roles+in+mouse+germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification.</a> Development. 128, 481-490 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+MEFs+to+Matrigel+I%3A+Passaging+hESCs+in+the+Presence+of+MEFs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

An der Mississippi State University: Diese Arbeit wurde nach Überprüfung und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Genehmigung unserer Maus-Protokoll # 08030 (Holding und Zucht-Protokoll Die Rolle von reaktiven Sauerstoffspezies-ROS in der Keimbahn Entwicklung und Tumorbildung) durchgeführt.

Zange Nr. 14 und 15, Skalpell 35 mm, Dissektion Scheren, chirurgischen Bereichen, antimikrobielle Seife, Kochsalzlösung 0,9%, Gaze, Eis-Schaum-Behälter, Rasierklinge, Skalpell 35 mm, feinen Pinzette Nr. 4 und 5, feine Hänseleien Nadel mit Griff-, Filter-Papierbögen, und zog Glaspipetten.<br /<br /&gt; Equipment: Sezieren Stereomikroskop Lichtquelle Schott Fostec, inverse Mikroskop Mikropipette 10 und 200 &amp;mgr; l, Zentrifuge, bio Sicherheit Kabinett.

isolation und ableitung von embryonalen maus-keimzellen

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen (EG) in primordialen Keimzellen (PGC) und später in Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum (DPC) Maus-Embryonen zu isolieren. Die Entwicklung der Gonaden Kämme aus Maus-Embryonen (C57BL6J) wurden durch mechanische Störungen mit Kollagenase, dann in einem Maus-Embryo-Fibroblasten-Feeder-Schicht (MEF-CF1), die zuvor mitotisch mit Mitomycin C wurde in Anwesenheit von Knockout-Medien inaktiviert und ergänzt mit Leukämie Inhibitor vernickelt dissoziiert Factor (LIF), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Stem Cell Factor (SCF). Mit diesen optimierten Methoden für PCG Identifikation, Isolierung und Etablierung der Kulturbedingungen ermöglicht langfristig Kulturen von EG-Zellen für mehr als 40 Tage. Die embryonalen Keimzelle Linien zeigten embryonalen Phänotyp und die Expression von häufig verwendeten Marker der pluripotenten Zustand. Isolation und Ableitung von Keimzellen in der Kultur ein Instrument, um ihre Entwicklung in vitro zu verstehen und bieten die Möglichkeit, kumulative Schäden an genetischen und epigenetischen zu überwachen nach der Exposition gegenüber oxidativem Stress.

Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen in primordialen Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum Maus-Embryonen zu isolieren.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

Die Fähigkeit embryonaler Keimzellen (EG), während der frühen Entwicklung in primordiale Keimzellen (PGCs) und später in Gameten zu differenzieren ...

Hallo, mein Name ist Har Moreno vom Labor für Reproduktionsgenetik und Stammzellen der Mississippi State University. Hallo, mein Name ist Clara St. Auch für das Labor für Reproduktionsgenetik und Stammzellen der Mississippi State University. Prämortale Keimbahnzellen oder PGC sind die Vorläuferzellen der Armonia und Voia im Eierstock beziehungsweise im Hoden.Bei Maus-Embryonen wandern die PGC vom Darm und über den Genitalwulst zwischen 8,5 und 9,5 Tagen. Danach erreichen die PGC den Genitalwulst zwischen 10,5 und 11,5 Tagen.TAs Postum und beginnen, die gonadale Ausstülpung bei weiblichen D-Individuen zu bilden. Die pg-Zellen wandern zum seitlichen Ende der Niere, um die weibliche gonadale Ausstülpung zu bilden. Im Gegensatz dazu wandern die PGCs beim Männchen zu beiden Seiten der Harnblase.Um mit der Entstehung zu beginnen. Die männlichen Alridge-Ger-Zellen sind ein hervorragendes Forschungsmodell, um onkogene Entwicklungswege unter Bedingungen von oxidativem Stress als Ursache für Unfruchtbarkeit und Krebs zu untersuchen. Beginnen wir also.Heute zeigen wir Ihnen, wie man PV-Zellen aus sich entwickelnden Gonadenleisten von 10,5 bis 11,5 Tage post coitum alten Maus-Embryonen gewinnt und isoliert. Die Gonadenleisten werden durch mechanische Dissoziation aufgelöst und auf eine aus Mundembryo-Fibroblasten bestehende Feeder-Schicht aufgebracht. Nach 10 Tagen Kultivierung unter optimierten Bedingungen bilden sich embryonale Keimkolonien mit embryonalem Phänotyp aus. Auch nach Passagen können sie anhand der Expression von pluripotenten Markern identifiziert werden.Für diesen Schritt der sterilen Dissektion werden die folgenden Materialien benötigt: Verpackung mit sterilen Feldern, Pinzette, Schere, Rasierklingen, antimikrobielle Seifen, Kochsalzlösungen, Petrischale gefüllt mit PBS Pep auf Eis und Mullbinden sowie eine trächtige C57BL/6-weibliche Maus im Alter von 10,5 bis 11 Tagen. Das Tier wird durch Halswirbelausrenkung euthanasiert. Reinigen Sie den Bauchbereich mit antimikrobieller Seife und rasieren Sie ihn anschließend.Spülen Sie den Bauchraum mit Kochsalzlösung aus. Trocknen Sie ihn mit einer sterilen Gaze ab. Bedecken Sie die Maus mit einem neuen sterilen Tuch.Führen Sie einen ventralen Schnitt mit einer Pinzette und einer Schere durch. Identifizieren Sie die gesamte Gebärmutter in der Bauchhöhle und entfernen Sie sie. Die Embryonen sind im Inneren der Gebärmutter sichtbar.Sehr vorsichtig. Durch die Bänder führen, die noch am Uterushorn befestigt sind. Beenden Sie die Präparation durch einen Querschnitt entlang der Vagina.Überführen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale, versiegeln Sie sie mit GPVS und bewahren Sie sie auf Eis auf. Trennen Sie das extraembryonale Gewebe von den Mundembryonen unter Verwendung eines sterilen Skalpells und einer Pinzette.Überführen Sie die Mundembryonen in eine frische Petrischale, die mit DPBS gefüllt ist. Messbare Länge des Mundembryos. Wir stellten fest, dass die Größen je nach Embryonalalter unterschiedlich waren.Zum Beispiel wurden 8,5 Tage post coitum durchschnittlich sechs Millimeter gemessen, 10,5 Tage post coitum durchschnittlich 11 Millimeter und 12,5 Tage post coitum durchschnittlich 16 Millimeter. Entfernen Sie ihre Schwänze zur DNA-Extraktion. Für die Dissektion werden folgende Materialien benötigt: Stereomikroskop, Sicherheitswerkbank, PDS, steriles Skalpell.Sterile feine Pinzette, sterile feine Zupfnadel mit Griff, Petrischale, Filterpapierscheiben. Legen Sie ein Filterpapier in eine Petrischale und darauf den Mundembryo, um den Embryo zu trocknen und für die Dissektion zu fixieren. Führen Sie unter einem Stereomikroskop mit einem sterilen Skalpell einen Querschnitt am Mundembryo oberhalb des Ansatzes der Nabelschnur durch.Unter Verwendung steriler feiner Pinzette und einer sterilen feinen Zupfnadel. Entfernen Sie die Eingeweide und die Leber, sodass das Harnsystem sichtbar ist. Die Harnblase befindet sich in einer medianen Ebene.Das Embryo kann als männlich identifiziert werden, da die gonadalen Brücken beidseits der Harnblase liegen. Entfernen Sie mithilfe steriler feiner Pinzette und einer sterilen feinen Nadel den rechten männlichen Gonadenwulst, indem Sie das sie tragende Gewebe herausschneiden. Wenden Sie das gleiche Verfahren an, um den linken männlichen Genitalwulst zu entfernen.Überführen Sie beide männlichen Genitalwülste mikroskopisch in eine kleine Petrischale, die frisches DPDS enthält. Sie können den männlichen Gonadenwulst, der an der Meso-Nebenniere angeheftet ist, sichtbar machen. Die männlichen Gonadenwülste sollten unter dem Stereomikroskop groß und oval geformt erscheinen.Entfernen Sie den Darm mithilfe steriler feiner Pinzette und einer sterilen feinen Präpariernadel. Die Nieren befinden sich seitlich in der Bauchhöhle, die Harnblase liegt im Vergleich zur Niere medialer und kaudaler. Der weibliche Gonadenwulst unterscheidet sich vom männlichen Gonadenwulst aufgrund seiner Morphologie und anatomischen Lage. Die weiblichen Keimdrüsenleisten sind fest am kaudalen lateralen Ende der Niere befestigt. Mit sterilen feinen Pinzetten und einer sterilen feinen Nadel. Entfernen Sie die linke weibliche Keimdrüsenleiste, indem Sie das sie mit der Niere verbindende Gewebe durchtrennen.Wiederholen Sie denselben Vorgang, um den rechten weiblichen Keimwalt zu entfernen. Überführen Sie beide weiblichen Keimwälter in eine kleine Petrischale, die frisches PDS enthält. Man kann den am Neso Nera befestigten männlichen Keimwalt mikroskopisch sichtbar machen.Diese weiblichen Gonadenwülste sollten länglich geformt sein und im Vergleich zu den männlichen Gonadenwülsten kleiner sein, wobei sterile, feine und scharfe Nadeln verwendet werden. Trennen Sie die weiblichen Gonadenwülste mit sterilen, feinen und scharfen Nadeln vom Mesoderm und anderen somatischen Geweben. Trennen Sie die männlichen Gonadenwülste vom Mesonephros und anderen somatischen Geweben.Es ist wichtig, das mesonemale Gewebe aus dem genitalen Fortpflanzungsleisten-Kamm zu entfernen, da es sich um ein somatisches Gewebe handelt, das im Prozess der PGC-Gewinnung überwuchern würde. Sammeln Sie den Gonadenkamm in einem Tropfen von 0,5 Mikroliter frischem DPVS mit Kollagenase-Lösung. Unter einem Stereomikroskop werden die Gonadengewebe mit sterilen, feinen und scharfen Nadeln in kleine Stücke zerschnitten.Die Petrischalen werden für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator überführt. Nach 15 Minuten kann das Gewebe durch Pipettieren mit gezogenen Glas-Kapillarpipetten mit Durchmessern zwischen 40 und 100 Mikrometern dissoziiert werden. Zerstückeln Sie die Gewebeproben durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.Dadurch entstehen kleine Klumpen. Diese kleinen Klumpen werden nach dem Waschen mit 0,5 Mikrolitern DPDX gewaschen. Anschließend werden sie fünf Minuten lang bei 2000 U/min in Eend-Würfel überführt.Bei Raumtemperatur nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Pellet in 0,5 Milliliter ergänztem, knock-out Medium resuspendiert, das 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Vor diesem Vorgang sollten Sie eine Schicht aus mit Mykosen inaktivierten Mausembryonal-Fibroblasten (Meth CCF) als Futterzellschicht unmittelbar vor dem Ansäen der PGC vorbereiten. Das Kulturmedium muss von der vorbereiteten Futterzellschicht entfernt werden.Gegeben Sie dann punktweise Milliliter des zuvor auf 37 Grad Celsius erwärmten supplementierten Knockout-Mediums auf die Meth-Unterlagszellschicht. Unter einem Stereomikroskop werden unter symmetrischer Verteilung kleine Ansiedlungen von PT-GC auf den Meth-Unterlagszellschichten ausplattiert. Befinden sich diese Stücke zu nahe beieinander, neigen sie zur Aggregation und bilden dichte Kolonien, die schlecht anhaften oder mit der Differenzierung in der Kultur beginnen.Die Kulturschalen müssen mit dem Namen der embryonalen Keimzelllinie, der Passagezahl und dem Datum beschriftet werden. Überführen Sie die Kulturschalen vorsichtig in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂. Nach 10 Tagen ab der Isolierung können Sie Kolonien embryonaler Keimzellen anhand ihrer charakteristischen Morphologie identifizieren. Außerdem können sie nach der ersten Passage anhand der Expression von pluripotenzassoziierten Markern wie alkalischer Phosphatase, Oct4, SSEA-1 und Sox2 identifiziert werden.Heute zeigen wir Ihnen, wie man isolierte und kultivierte embryonale Keimzellen aus PGCs von Mäusen 10,5 bis 11,5 Tage nach der Paarung gewinnt. Die Charakterisierung embryonaler Keimzellen als Vorläuferzellen der Keimbahn ist entscheidend für das Verständnis von Prozessen, die mit der Gametogenese, Fruchtbarkeit und Krebs in Zusammenhang stehen.Vielen Dank für das Anschauen unseres Videos. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Biologie

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