Murine Colitis Modeling mit Dextransulfat Sodium (DSS)

Mäuse erhalten vier Tage lang 3% DSS bei der Libido. Während das Gewicht und das Vorhandensein von Durchfall und Stuhlblut täglich aufgezeichnet werden, wird TSS nach dem vierten Tag durch Autoklavenwasser ersetzt. Nach drei Tagen mit Wasser werden die Mäuse eingeschläfert und ihre Dickdarme entfernt.

Der Dickdarm wird vermessen und gewogen. Die Dickdarme werden dann entweder zu Schweizer Brötchen oder Würstchen geformt und unter dem Mikroskop untersucht. Dieser Videoartikel zeigt die Entnahme und Verarbeitung von Dickdarm in einem Murn-Modell der Kolitis.

Dieses Verfahren wird verwendet, um Colitis im Labor von Dr. Christopher Williams vom Department of Cancer Biology an der Vanderbilt University zu untersuchen, bevor mit der Behandlung mit Dextrinsulfat-Natrium begonnen wird. Die Ausgangsgewichte werden im Verlauf des Experiments ermittelt. Nach dem Wiegen der Mäuse werden tägliche Gewichte genommen, wobei ein Gewicht von 3 % pro Volumen, Dextrinsulfat-Natriumsalzlösung oder DSS in Wasser hergestellt wird.

Das DSS muss ein niedriges Molekulargewicht haben, damit dieses Modell wirksam ist, genügend DSS-Lösung herstellen, um eine Wasserflasche für jeden Käfig mit Mäusen zu füllen, und die Lösung mit einem 0,45-Mikrometer-Celluloseacetat-Filter filtrieren. Ersetzen Sie die Trinkwasserflasche im Mauskäfig durch eine Flasche mit 3%iger DSS-Lösung. Wenn Ihre Einrichtung ein automatisches Bewässerungssystem verwendet, platzieren Sie Ausschlusshinweise an den Bewässerungsausläufen, um sicherzustellen, dass die Mäuse keinen Zugang zu einer anderen Wasserquelle haben.

Nach vier Tagen werden die Mäuse erneut gewogen, um die systemischen Folgen der Kolitis zu quantifizieren. Gewichtsverlust ist bei schweren Verletzungen üblich, kann jedoch erst mehrere Tage am selben Tag sichtbar sein. Am vierten Tag ersetzen Sie die DSS-Lösung für weitere drei Tage durch Wasser, um eine gewisse Erholung des Dickdarmepithels zu ermöglichen.

Drei Tage später, am siebten Tag, werden die Mäuse erneut gewogen. Der Dickdarm kann dann von den euthanasierten Mäusen entnommen werden, wie im nächsten Abschnitt gezeigt. Um den Dickdarm zu entnehmen, legen Sie die ventrale Seite der euthanasierten Maus frei, um einen ungehinderten Zugang zum Bauch zu gewährleisten.

Befeuchten Sie den Bauch vollständig mit 70% Ethanol. Fassen Sie die Mittellinie des Bauches mit einer Gewebezange und heben Sie sie an. So wird die Haut mit einer feinen Schere gezeltet.

Schneiden Sie den Bauch ein, um den Bauchinhalt freizulegen. Verlängern Sie den Schnitt bis zur Spitze des Processus xiphoideus an der Mittellinie und verlängern Sie ihn dann bilateral entlang der unteren Seite der Rippenränder. Identifiziere den Dünndarm, den Blinddarm und den Dickdarm.

Präparieren Sie vorsichtig den Dickdarm aus dem umgebenden Mesenterium. Danach den Dickdarm durchtrennen und das Becken vertiefen, um es freizubekommen. Der distale Dickdarm vom Enddarm.

sollte darauf geachtet werden, dass keine Arterien oder Venen durchtrennt werden. Seien Sie sich auch bewusst, dass der Dickdarm leicht reißen kann. Entfernen Sie also vorsichtig den Dickdarm aus dem Mesenterium.

Der Dickdarm wird am Rand der Colóna sequel durchtrennt, um den proximalen Dickdarm zu befreien. Entfernen Sie den Dickdarm und intubieren Sie den Dickdarm mit einer 20-Gauge-Ernährungsnadel und einer 10-Milliliter-Spritze und spülen Sie den Dickdarm mit eiskaltem PBS, bis das EIT vollständig frei von Stuhl ist. Es ist wichtig, die korrekte Ausrichtung des Dickdarms beizubehalten, indem Sie das distale Ende des Dickdarms am nächsten zu Ihnen halten.

Beginnen Sie damit, die Doppelpunktlänge mit einem digitalen Messschieber zu messen. Die Dickdarmlänge ist ein weiterer Indikator für die Schwere der Verletzung. Colitis erhöht das Ödem und verkürzt die Gesamtlänge des Dickdarms.

Zu diesem Zeitpunkt können die entnommenen Dickdarme entweder als Würste für die makroskopische Analyse verarbeitet oder zu Schweizer Rollen für die histologische Analyse der akuten Kolitis verarbeitet werden. Wir werden diese Techniken in den folgenden Abschnitten demonstrieren, um den Dickdarm als Wurst zu verarbeiten: Für die makroskopische Analyse des gesamten Dickdarms ist es wichtig, die korrekte Ausrichtung des Dickdarms beizubehalten. Halten Sie daher das distale Ende des Dickdarms am nächsten bei Ihnen.

Schneiden Sie zwei Stücke nicht resorbierbares Nahtmaterial, eines etwa einen Zoll lang und das andere zwei Zoll lang. Verwenden Sie das zwei Zoll lange Stück Naht, um das distale Ende des Dickdarms so nah wie möglich am Rand abzubinden und gleichzeitig eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Führen Sie dann eine 20-Gauge-Ernährungsnadel mit fünf Millilitern 10% gepuffertem Formalinphosphat in das proximale Ende des Dickdarms ein.

Binden Sie das verbleibende Stück Naht unmittelbar proximal locker an den Kolben der Ernährungsnadel. Fassen Sie nun den Dickdarm fest an der Kugel der Ernährungsnadel und infundieren Sie eine ausreichende Menge Formalin, um sicherzustellen, dass der Dickdarm erweitert wird. Ziehen Sie den Knoten in der Naht fest, während Sie die Zuführnadel zurückziehen, so dass der infundierte erweiterte Dickdarm übrig bleibt.

Als Wurst füllen Sie ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 % gepuffertem, formellem und Phosphat und beschriften das Röhrchen. Legen Sie den Dickdarm in die Röhre und fixieren Sie ihn für 24 Stunden. Gießen Sie das Formin nach 24 Stunden in einen geeigneten Abfallbehälter ab und ersetzen Sie es für weitere 24 Stunden durch 70 % Ethanol.

Dickdarm kann in 70%igem Ethanol unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. Wenn Sie bereit sind, den Dickdarm zu analysieren, entfernen Sie ihn aus dem konischen Schlauch. Schneide die Saiten an jedem Ende mit einem Skalpell ab und achte darauf, den Dickdarm nicht zu beschädigen.

Denken Sie daran, dass das distale Ende das längste Stück Schnur hat. Schneiden Sie den Dickdarm vom distalen zum proximalen Ende in Längsrichtung ab, so dass er ein langes Blatt bildet. Der Dickdarm kann nun unter einem Präpariermikroskop betrachtet werden.

Schneide den Doppelpunkt in Längsrichtung ab und lege den Doppelpunkt als flaches Blatt aus. Das Rollen des Dickdarms erfordert zwei Paar Zangen und eine beidhändige Technik. Fassen Sie beide lateralen Ränder des distalen Dickdarmrandes mit einer Zange und rollen Sie den Dickdarm nacheinander durch Drehen und Loslassen der Pinzette zum proximalen Rand, wodurch eine Spirale mit einer dritten Dimension oder Schweizer Rolle erzeugt wird.

Wenn der Doppelpunkt am Watman-Papier haftet, befeuchten Sie das Papier und den Doppelpunkt mit einer kleinen Menge PBS, um die Form zu erhalten. Fassen Sie die Rolle mit einer Pinzette fest und durchstechen Sie sie mit einer 27-einhalb-Gauge-Nadel. Sichern Sie die Rolle, indem Sie die Nadel biegen, wenn sie die Rolle verlässt.

Legen Sie nun die Rolle in eine beschriftete Taschentuchkassette und legen Sie die Kassette in ein Glas mit 10% gepuffertem Formalinphosphat. Lassen Sie es 24 Stunden lang bei Raumtemperatur, um das Gewebe zu fixieren. Gießen Sie nach 24 Stunden das Formalin ab und ersetzen Sie es für weitere bis vier Stunden durch 70%iges Ethanol.

Dickdarm kann in 70%igem Ethanol unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. Dieses Modell ermöglicht es dem Forscher, Dickdarm zu gewinnen, zu fixieren und zu analysieren und so den Schweregrad der Kolitis zu analysieren. Für die makroskopische Analyse des gesamten Dickdarms kann der Dickdarm als Wurst verarbeitet werden, die mit Formalin aufgegossen und vollständig expandiert wird.

Die offene Wurst sollte flach liegen. Wenn die Wurstmethode korrekt durchgeführt wurde, wird der fixierte Dickdarm erweitert und die gesamte Schleimhautoberfläche kann leicht manipuliert und unter dem Präpariermikroskop betrachtet werden. Für die histologische Analyse kann der Dickdarm als Schweizer Rolle aufbereitet werden.

Die Rolle wird mit einer Nadel gesichert und zur Fixierung in eine Gewebekassette gelegt. Wenn die Rolle geschnitten und montiert wird, sollte sie bei richtigem Rollen eine repräsentative Scheibe des gesamten Dickdarms bilden, Abschnitte der Schweizer Rolle können mit Hämatin und ASIN gefärbt werden, um das Ausmaß der Dickdarmverletzung zu bestimmen. Denken Sie daran, dass sich das distale Ende des Dickdarms in der Mitte der Rolle auf der Folie befindet.

In diesem Beispiel sind Entzündungen und Kryptenschäden bei der DSS-behandelten Dickdarm im Vergleich zu einer wasserbehandelten Kontrolle offensichtlich. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Dickdarm aus einem Mausmodell der akuten Kolitis entnehmen und verarbeiten können. Wenn du dieses Verfahren durchführst, ist es wichtig, dass du gut organisiert bist, bevor du opferst.

Bei den Mäusen zum Beispiel sind alle Röhrchen und Kassetten für jede Maus beschriftet und alle Werkzeuge und Reagenzien sind griffbereit. Führen Sie außerdem detaillierte Aufzeichnungen über das Gewicht der Maus und die Doppelpunktlänge. Stellen Sie abschließend sicher, dass Sie genügend Zeit für die Bearbeitung eingeplant haben.

Normalerweise dauert es 15 Minuten pro Maus für einen Anfänger und sechs bis acht Minuten für jemanden, der mehr Erfahrung in dieser Technik hat.