Murine Colitis Modeling mit Dextransulfat Sodium (DSS)

Mäusen wird über vier Tage hinweg 3 % DSS ad libitum verabreicht. Während Gewicht sowie das Auftreten von Durchfall und Blut im Stuhl täglich erfasst werden, wird das DSS nach Tag vier durch autoklaviertes Wasser ersetzt. Nach drei Tagen Wasserbehandlung werden die Mäuse euthanasiert und ihre Kolons entnommen.

Die Kolons werden gemessen und gewogen. Anschließend werden die Kolons entweder zu Schweizerrollen oder Würsten geformt und unter dem Mikroskop untersucht. Dieser Videoartikel demonstriert die Gewinnung und Aufbereitung der Kolons in einem Mausmodell der Kolitis.

Dieses Verfahren wird im Labor von Dr. Christopher Williams der Abteilung für Krebsbiologie an der Vanderbilt University verwendet, um Colitis zu untersuchen, bevor mit der Behandlung mit Dextrinsulfat-Natrium begonnen wird. Während des gesamten Experiments werden Ausgangsgewichte ermittelt. Tägliche Gewichtsbestimmungen erfolgen, nachdem die Mäuse gewogen wurden; man stellt eine 3-%-Gewicht pro Volumen-Lösung aus Dextrinsulfat-Natriumsalz oder DSS in Wasser her.

Das DSS muss ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, damit dieses Modell wirksam ist; bereiten Sie ausreichend DSS-Lösung zu, um eine Wasserflasche für jeden Mäusekäfig zu füllen, und filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45-Mikrometer-Celluloseacetat-Filter. Ersetzen Sie die Trinkwasserflasche im Mäusekäfig durch eine Flasche mit 3%iger DSS-Lösung. Falls Ihre Einrichtung ein automatisiertes Bewässerungssystem verwendet, bringen Sie Absperrspitzen an den Wasserspendern an, um sicherzustellen, dass die Mäuse keinen Zugang zu einer anderen Wasserquelle haben.

Nach vier Tagen werden die Mäuse erneut gewogen, um systemische Folgen der Kolitis zu quantifizieren. Gewichtsverlust tritt häufig bei schweren Schäden auf, kann jedoch am selben Tag noch nicht sichtbar sein und sich erst einige Tage später zeigen. Am vierten Tag wird die DSS-Lösung durch Wasser ersetzt, um weitere drei Tage lang eine partielle Regeneration des kolorektalen Epithels zu ermöglichen.

Drei Tage später, am Tag sieben, werden die Mäuse erneut gewogen. Der Colon kann dann von den euthanasierten Mäusen wie im nächsten Abschnitt gezeigt entnommen werden. Um den Colon zu entnehmen, exponieren Sie die ventrale Seite der euthanasierten Maus, um ungehinderten Zugang zum Abdomen zu gewährleisten.

Befeuchten Sie den Bauch vollständig mit 70 % Ethanol. Greifen Sie die Mittellinie des Bauches mit Gewebetupfern und heben Sie diese an. Zeltet so die Haut mit feinen Spitzenscheren.

Eröffnen Sie den Bauch, um die Bauchorgane freizulegen. Verlängern Sie den Schnitt bis zur Spitze des Xiphoidfortsatzes in der Mittellinie und führen Sie ihn dann beidseitig entlang der unteren Begrenzung der Rippenbögen fort. Identifizieren Sie Dünndarm, Blinddarm und Colon.

Dissezieren Sie den Dickdarm vorsichtig aus dem umgebenden Mesenterium heraus. Danach durchtrennen Sie den Dickdarm, um ihn tiefer im Becken freizulegen. Den distalen Dickdarm vom Rektum.

Es ist darauf zu achten, dass keine Arterien oder Venen durchtrennt werden. Außerdem sollte beachtet werden, dass der Dickdarm leicht einreißen kann. Entfernen Sie daher vorsichtig den Dickdarm vom Mesenterium.

Querexzidieren Sie den Dickdarm am Kolonasequelrand, um den proximalen Dickdarm zu lösen. Entfernen Sie den Dickdarm vollständig und intubieren Sie ihn mit einer Fütterungsnadel der Größe 20 und einer 10-mL-Spritze, um den Dickdarm mit eiskaltem PBS so lange zu spülen, bis das EIT vollständig frei von Stuhl ist. Es ist wichtig, die korrekte Orientierung des Dickdarms beizubehalten, indem Sie das distale Ende des Dickdarms stets am nächsten zu sich halten.

Messen Sie zunächst die Kolonlänge mit einem digitalen Messschieber. Die Kolonlänge ist ein weiterer Indikator für die Schwere der Verletzung. Eine Kolitis verstärkt das Ödem und verkürzt die Gesamtlänge des Kolons.

An diesem Punkt können die gewonnenen Kolons entweder als Wurst für die makroskopische Analyse verarbeitet oder als Schweizerrolle präpariert werden, um eine histologische Analyse einer akuten Kolitis durchzuführen. Wir werden diese Techniken in den folgenden Abschnitten demonstrieren, um das Kolon als Wurst zu verarbeiten. Für die makroskopische Analyse des gesamten Kolons ist es wichtig, die korrekte Orientierung des Kolons beizubehalten. Deshalb sollte das distale Ende des Kolons stets am nächsten zu Ihnen bleiben.

Schneiden Sie zwei Stücke nicht resorbierbares Nahtmaterial zurecht, eines etwa einen Zoll lang und das andere zwei Zoll lang. Verwenden Sie das zwei Zoll lange Nahtstück, um das distale Ende des Kolons so nah wie möglich an den Rändern abzuklemmen, wobei dennoch eine gute Abdichtung gewährleistet bleibt. Anschließend wird eine 20-Gauge-Fütterungsnadel, die fünf Milliliter 10%igen gepufferten Formalinphosphat enthält, in das proximale Ende des Kolons eingeführt.

Binden Sie das verbleibende Stück Faden unmittelbar proximal zur Birne der Fütterungsnadel locker zu. Greifen Sie nun fest am Kolon an der Birne der Fütterungsnadel und spritzen Sie eine ausreichende Menge Formalin ein, wobei sichergestellt werden muss, dass sich der Kolon ausdehnt. Ziehen Sie den Knoten im Faden straff, während Sie die Fütterungsnadel zurückziehen, sodass der infundierte, aufgeblähte Kolon zurückbleibt.

Als Wurst füllen Sie ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen mit 10 % gepuffertem Formalin und Phosphat und beschriften Sie das Röhrchen. Legen Sie den Dickdarm in das Röhrchen und fixieren Sie ihn 24 Stunden lang. Gießen Sie nach 24 Stunden das Formalin in einen geeigneten Abfallbehälter ab und ersetzen Sie es durch 70 %igen Ethanol für weitere 24 Stunden.

Das Kolon kann unbegrenzt bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol aufbewahrt werden. Wenn Sie bereit sind, das Kolon zu analysieren, nehmen Sie es aus dem kegelförmigen Reagenzglas heraus. Durchtrennen Sie vorsichtig mit einem Skalpell die Schnüre an beiden Enden, ohne das Kolon zu beschädigen.

Beachten Sie, dass das distale Ende das längste Stück Schnur hat. Schneiden Sie den Kolon entlang der Längsachse vom distalen zum proximalen Ende auf, sodass er eine lange Fläche bildet. Der Kolon kann nun unter einem Stereomikroskop betrachtet werden.

Schneiden Sie den Kolon längs auf und legen Sie ihn als flache Scheibe aus. Das Aufrollen des Kolons erfordert zwei Pinzettenpaare und eine zweihändige Technik. Greifen Sie mit den Pinzetten beide seitlichen Ränder des distalen Kolonrandes und rollen Sie den Kolon schrittweise auf, indem Sie die Pinzetten drehen und wieder lösen, bis zum proximalen Rand, wodurch sich eine spiralförmige Struktur mit einer dritten Dimension, eine sogenannte „Swiss-Roll“, bildet.

Falls der Darm an dem Watman-Papier haftet, befeuchten Sie das Papier und den Darm mit einer kleinen Menge PBS, um die Form zu erhalten. Greifen Sie die Rolle fest mit einer Pinzette und durchtrennen Sie sie mit einer Nadel der Größe 27,5. Sichern Sie die Rolle, indem Sie die Nadel abbiegen, während sie die Rolle verlässt.

Legen Sie nun die Probe in eine beschriftete Gewebekassette und geben Sie die Kassette in ein Gefäß mit 10% gepuffertem Formalinphosphat. Lassen Sie sie 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, um das Gewebe zu fixieren. Nach 24 Stunden gießen Sie das Formalin ab und ersetzen es durch 70 % Ethanol für zusätzliche vier Stunden.

Das Kolon kann unbegrenzt bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol aufbewahrt werden. Dieses Modell ermöglicht es dem Forscher, das Kolon zu gewinnen, zu fixieren und zu analysieren, wodurch eine Beurteilung des Schweregrads der Kolitis möglich wird. Für die makroskopische Untersuchung des gesamten Kolons kann das Kolon wie eine Wurst verarbeitet werden, die mit Formalin infundiert und vollständig aufgebläht wird.

Die geöffnete Wurst sollte flach liegen. Wenn die Wurst-Methode korrekt durchgeführt wurde, ist der fixierte Colon dilatiert, und die gesamte Mukosaoberfläche kann leicht manipuliert und unter dem Auflichtmikroskop betrachtet werden. Für die histologische Analyse kann der Colon als Schweizer Rolle aufgearbeitet werden.

Die Rolle wird mit einer Nadel fixiert und in eine Gewebekassette zur Fixierung gegeben. Wenn die Rolle geschnitten und auf einen Objektträger aufgebracht wird, sollte sie bei korrekter Durchführung einen repräsentativen Querschnitt des gesamten Kolons ergeben. Schnitte der Schweizer Rolle können mit Hämatin und ASIN gefärbt werden, um das Ausmaß der kolorektalen Schädigung zu bestimmen. Beachten Sie, dass das distale Ende des Kolons in der Mitte der Rolle auf dem Objektträger liegt.

In diesem Beispiel sind Entzündungen und Schäden an den Krypten im mit DSS behandelten Kolon im Vergleich zur Wasser-behandelten Kontrolle erkennbar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Kolons aus einem murinen Modell einer akuten Kolitis gewinnt und verarbeitet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie vor der Tötung gut organisiert sind.

Die Mäuse haben beispielsweise alle Schläuche und Kassetten für jede Maus beschriftet, und alle Geräte und Reagenzien sind leicht zugänglich. Außerdem sollten detaillierte Aufzeichnungen über das Körpergewicht der Mäuse und die Kolonlänge geführt werden. Schließlich muss sichergestellt sein, dass ausreichend Zeit für die Probenaufarbeitung eingeplant wurde.

Normalerweise dauert es pro Maus 15 Minuten für eine Anfängerin und sechs bis acht Minuten für jemanden mit mehr Erfahrung in dieser Technik.