Name: Murine Colitis Modeling mit Dextransulfat Sodium (DSS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Lernen Sie die Induktion akuter Kolitis bei Mäusen mit Dextransulfat-Natrium (DSS) im Trinkwasser. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare histologische Analysen des Dickdarms.

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Eine Förderung von NIH (1 K08 DK080221-01) und Vanderbilt institutionellen Fonds für die Entwicklung.

Teil 1: Injury-Repair Colitis Modell <ol><li> Baseline Gewicht sollte für jede Maus vor Beginn der DSS-Behandlung erzielt werden. </li><li> Für eine 3% (w / v) Dextransulfat Natriumsalz-Lösung in Wasser und Filter mit einem 0,45 um Celluloseacetat-Filter. </li><li> Ersetzen Sie Trinkwasser in der Maus Käfig mit 3% DSS-Lösung für 4 Tage. Die Mäuse sollten keinen Zugang zu einer anderen Quelle von Wasser (dh Ausschluss Tipps automatisierte Bewässerungssysteme angelegt). </li><li> Am vierten Tag, ersetzen Sie die DSS-Lösung mit Wasser für weitere drei Tage, so dass einige Kolon Epithelzellen Erholung. Die Mäuse sollten am vierten Tag gewogen werden, um systemische Auswirkungen der Kolitis zu quantifizieren. Der Gewichtsverlust ist mit schweren Verletzungen häufig. </li><li> Am Tag 7 wiegen und Opfer der Mäuse. Mäuse durch inhalative Überdosis Isofluran oder anderen institutionell kann eingeschläfert werden, genehmigt IACUC Methoden. </li></ol> Teil 2: Necropsy und Ernte von Colon <ol><li> Expose der Bauchseite der Maus und sichere Beine zu ungehinderten Zugang zu den Unterleib zu gewährleisten. Wet den Bauch komplett mit 70% Ethanol. </li><li> Fassen Sie die Mittellinie des Bauches mit dem Gewebe einer Pinzette und erstrecken sich nach oben so Zelten der Haut. Verwenden Sie spitzen Schere den Bauch damit Freilegung der Bauch-Inhalte incise. Erweitern Sie den Einschnitt an der Spitze der Schwertfortsatz an der Mittellinie und dann entlang der unteren Seite der Rippenbogen bilateral zu verlängern. </li><li> Identifizieren Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Sorgfältig sezieren / necken den Dickdarm aus den umliegenden Mesenterium. Transect dem Doppelpunkt tief im Becken an dem distalen Kolon und Rektum frei. Transect den Doppelpunkt am colonocecal Marge auf den proximalen Kolon frei. Es muss während dieses Prozesses ergriffen werden nicht auf den Doppelpunkt als Reinigung des Dickdarms wird es problematisch, wenn Perforation tritt Schäden. </li><li> Mit einer 20G Fütterung Nadel und 10 ml Spritze, intubieren und bündig den Doppelpunkt mit eiskaltem PBS, bis das Eluat ist völlig frei von Stuhl. </li><li> An diesem Punkt, wenn makroskopische Analyse mit einem Binokular gewünscht wird, kann die Doppelpunkte als "Würstchen" fixiert werden. Wenn histologische Analyse nur gewünscht wird, als Teil gehen 4 "machen Swiss Rolls für die histologische Analyse der akuten Colitis". </li></ol> Teil 3: Verarbeitung als "Wurst" für makroskopische Analyse des gesamten Dickdarms <ol><li> Es ist wichtig, die richtige Ausrichtung des Dickdarms zu halten, daher halten das distale Ende des Dickdarms am nächsten an den Betreiber. Schneiden Sie zwei Stücke von nicht-resorbierbares Nahtmaterial (SP116 1,5 metrischen geflochtene Seide), eine ca. 1 cm in der Länge, die anderen 2 Zoll. </li><li> Verwenden Sie die 2-Zoll-Stück der Naht zu vernähen distalen Ende als an den Rand nahe wie möglich unter Beibehaltung einer guten Abdichtung. </li><li> Legen Sie eine 20G Nadel Fütterung mit 5 ml 10% gepuffertem Formalin Phosphat in das proximale Ende des Dickdarms. Lose Krawatte das verbleibende Stück der Naht unmittelbar proximal des Bulbus der Fütterung Nadel. Fassen Sie den Doppelpunkt fest an die Glühbirne der Fütterung Nadel und ziehen Formalin, bis der Darm erweitert wird. Ziehen Sie den Knoten in den Faden, wie Sie die Fütterung Nadel zurückziehen und verlassen damit den infundiert, erweitert Doppelpunkt als "Wurst". </li><li> Füllen Sie eine 15 ml konische Röhrchen mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat und Ort des Dickdarms in die Röhre. Fix für 24 Stunden. </li><li> Abgießen Formalin und ersetzen mit 70% EtOH für weitere 24 Stunden. (Doppelpunkte können in 70% EtOH unbegrenzt gelagert werden bei Raumtemperatur.) </li><li> Entfernen Sie den Doppelpunkt aus dem konischen Rohr und schneiden die Fäden an beiden Enden mit einem Skalpell, man aufpassen, nicht den Doppelpunkt beschädigen. Denken Sie daran, dass das distale Ende der längsten Stück Schnur hat. Cut in Längsrichtung von der distalen zum proximalen Ende des Dickdarms, so dass es ein langer Bogen bildet. An diesem Punkt kann der Darm unter einem Binokular betrachtet werden. </li></ol> Teil 4: Making Swiss Rolls für die histologische Analyse der akuten Colitis <ol><li> Es ist wichtig, die richtige Ausrichtung des Dickdarms zu halten, daher halten das distale Ende des Dickdarms am nächsten an den Betreiber. </li><li> Messen Sie die Länge Doppelpunkt. Diese Metrik ist ein weiterer Indikator für die Schwere der Verletzungen. Colitis erhöht Ödeme und verkürzt die gesamte Dickdarm Länge. </li><li> Mit spitzen Schere, längs einschneiden von distal nach proximal Ende des Dickdarms. Verwenden Sie feine Spitze Pinzette, um entweder Rand des Einschnitts zu erfassen und seitlich offen arbeiten Sie Ihren Weg nach distal-&gt; proximal, damit die Anzeige der Doppelpunkt als eine flache Platte. </li><li> Rollende den Dickdarm erfordert eine Pinzette und eine Zweihand-Technik. Fassen Sie entweder Rand des distalen Rand mit einer Pinzette. Gehen Sie nacheinander roll Dickdarm durch Drehen und Loslassen der Zange Verfahren zum proximalen Rand. So eine Spirale mit einer dritten Dimension oder "Swiss Roll".Zur Aufrechterhaltung der gerollter Form, fassen Sie die Rolle fest mit einer Pinzette und Transekt mit einem 27G1 / 2 Nadel. Befestigen Sie die Nadel durch Verbiegen der Nadel, sobald es aus der Rolle. </li><li> Legen Sie die Rolle in einem entsprechend gekennzeichneten Gewebekassette und in ein Glas mit 10% gepuffertem Formalin Phosphat bei Raumtemperatur für 24 Stunden zu Gewebefixierung zu gewährleisten. </li><li> Abgießen Formalin und ersetzen mit 70% EtOH für weitere 24 Stunden. (Doppelpunkte können in 70% EtOH unbegrenzt gelagert werden bei Raumtemperatur.) </li><li> Sobald die Probe festgesetzt worden ist, kann es sein, in Paraffin eingebettet, geschnitten und montiert auf Folien für die histologische Analyse. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse Das DSS-Modell für akute Kolitis erlaubt dem Forscher, zu erhalten, zu beheben, und zu analysieren, einen Doppelpunkt, dass die Modelle akuten Kolitis. Als die Schweizer Rolle geschnitten und montiert wird, sollte sie bilden einen repräsentativen Ausschnitt der gesamten Dickdarms, wenn gerollt richtig (Abbildung 1). Die montierten Rollen können mit H &amp; E angefärbt werden, um das Ausmaß der Schäden in den Dickdarm zu bestimmen, von dem distalen (innen) zum proximalen (außen) Ende (Abbildung 2). Immunhistochemie kann auch an der Schweizer Rolle zu identifizieren und zu quantifizieren Entzündungsinfiltrate durchgeführt werden. Wenn die Wurst-Methode korrekt abgelaufen ist, werden die festen Doppelpunkt erweitert werden und die gesamte Schleimhaut-Oberfläche können leicht manipuliert werden und unter dem Binokular (Abbildung 3) angesehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"></a> Abbildung 1. Die ordnungsgemäß ausgeführt "Swiss roll". (A) Der Doppelpunkt ist von distal nach proximal gerollt, durchtrennt mit einer Nadel und gesichert durch Biegen des Endes der Nadel. Es ist dann in einer Gewebekassette zur Fixierung angebracht. (B) H &amp; E gefärbten 5 &amp;mgr; Abschnitt eines Swiss roll aus dem Darm einer Maus mit DSS (d = distalen Kolon p = proximalen Kolon) behandelt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"></a> Abbildung 2. DSS behandelt Doppelpunkte Anzeichen einer akuten Kolitis. Entzündung und Krypta Schäden sind in der DSS-behandelten Dickdarm deutlich im Vergleich zu einem Wasser-behandelten Kontrollgruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1652/1652fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1652/1652fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"></a> Abbildung 3. Ein Beispiel für eine "Wurst". Die Wurst mit Formalin infundiert und komplett ausgebaut. Einem leichten Winkel wird anwesend sein zweitrangig gegenüber der natürlichen Krümmung des Dickdarms. Das eröffnet Wurst sollten flach.

<ol><li>Okayasu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Mtgr1+sensitizes+the+colonic+epithelium+to+dextran+sodium+sulfate-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis.</a> Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22Swiss+roll%22%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).</li>
<li>Aharoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+therapeutic+effect+of+glatiramer+acetate+on+several+murine+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease.</a> J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).</li>
<li>Hahm, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transforming+growth+factor+beta+signalling+in+the+intestine+contributes+to+tissue+injury+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 49 (2), 190-198 (2001).</li>
<li>Green, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+modulation+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+adherence+to+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).</li>
<li>Dieleman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+%28DSS%29+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Vanderbilt IACUC gesetzt durchgeführt.

Dieses Protokoll kann geändert werden, um akute Verletzungen, Verletzungen zu reparieren, oder chronische Dickdarm-Verletzung Prozesse zu modellieren. Akute Verletzungen Änderung: DSS-Behandlung ad lib für 4-6 Tage durch sofortige Opfer gefolgt Injury-Repair Änderung: Injury mit 4-6 Tagen DSS Behandlung durch Erholungsphase von 3-4 Tagen und Opfer (wie in oben beschriebenen Protokoll) gefolgt. <p class="jove...

<table><tbody><tr><td>Dextran-Sulfat-Natriumsalz</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>9011-18-1</td><td>molares Gewicht 40.000–50.000</td></tr><tr><td>10 % gepuffertes Formalinphosphat</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NDC 57319-474-06</td><td></td></tr><tr><td>TISSUE PATH Macrosette-Kassetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>15182706</td><td></td></tr><tr><td>BD 10-ml-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Äthylalkohol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>E190</td><td>Mit destilliertem Wasser auf 70 % verdünnen</td></tr><tr><td>20G-gerades Fütterungs-Needle</td><td>VWR international</td><td>20068-612</td><td></td></tr><tr><td>27G1/2 PrecisionGlide-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsscheren, scharfe/stumpfe Spitze</td><td>VWR international</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Waugh-Stopfer</td><td>VWR international</td><td>82027-428</td><td></td></tr><tr><td>Nicht resorbierbare Naht</td><td>LOOK Surgical</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>Whatman-Blottingpapier</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td>Nach Bedarf zuschneiden</td></tr><tr><td>Nalgene-Surfactant-freier Celluloseacetat-(SFCA)-Filter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06731-2</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Messschieber aus Kohlefaserverbund</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-007-958</td><td></td></tr></tbody></table>

murine colitis modeling mit dextransulfat sodium (dss)

Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)

- Morbus Crohn Colitis vor allem Colitis ulcerosa und die Kolon-Variante des Morbus Crohn, Colitis können von viralen oder bakteriellen Infektionen, ischämischen Insult oder Autoimmunerkrankungen auftreten. Akute Kolitis kann mit Bauchschmerzen und Blähungen, Malabsorption, Durchfall, Hämatochezie und Schleim im Stuhl zu präsentieren. Wir sind dabei, die komplexen Wechselwirkungen zwischen Umwelt, Genetik und epithelialen Barriere Dysfunktion bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Tiermodellen der Colitis wurden wesentliche Fortschritte in unserem Verständnis dieser Krankheit zu verstehen. Ein beliebtes Modell beinhaltet Ergänzung des Trinkwassers von Mäusen mit niedermolekularen Dextran Natriumsulfat (DSS), die sich in epithelialen Schäden und eine robuste entzündliche Reaktion in den Dickdarm mehrtägigen<sup&gt; 1</sup&gt;. Variationen dieser Ansatz kann verwendet werden, um akute Verletzungen, akuten Verletzungen, die durch Reparatur folgte, und wiederholten Zyklen von DSS mit Recovery-Modellierung chronisch-entzündlichen Erkrankungen durchsetzt Modell<sup&gt; 2</sup&gt;. Nach einem viertägigen Behandlung von 3% DSS im Trinkwasser, zeigen Mäuse Anzeichen einer akuten Colitis, einschließlich Gewichtsverlust, Blut im Stuhl und Durchfall. Mäuse sind am Ende der Behandlung natürlich eingeschläfert und bei der Autopsie seziert Doppelpunkte verarbeitet und kann &#39;Swiss gerollt &quot;<sup&gt; 3</sup&gt; Zu erlauben mikroskopische Analyse des gesamten Dickdarms oder infundiert mit Formalin als &quot;Würstchen&quot; zu makroskopischen Analyse zu ermöglichen. Das Gewebe wird dann in Paraffin eingebettet geschnitten und gefärbt zur histologischen überprüfen.

Dextransulfat-Natrium (DSS) im Trinkwasser verabreicht wird eine etablierte murine entzündlichen Verletzungen Modell der akuten Colitis. Dieses Protokoll beschreibt die Methode für die DSS-Behandlung und der Aufbereitung der Gewebe.

Murine Colitis Modeling mit Dextransulfat Sodium (DSS)

Eine Kolitis kann durch virale oder bakterielle Infektionen, ischämische Insulte oder Autoimmunerkrankungen verursacht werden; am bemerkenswertesten sind die Colitis ulcerosa und die kolische Variante von ...

Mäusen wird über vier Tage hinweg 3 % DSS ad libitum verabreicht. Während täglich Gewicht sowie das Vorhandensein von Durchfall und Blut im Stuhl erfasst werden, wird das DSS nach Tag vier durch autoklaviertes Wasser ersetzt. Nach drei Tagen Wasserzugabe werden die Mäuse getötet und ihre Kolons entnommen.Die Kolons werden gemessen und gewogen. Anschließend werden die Kolons entweder zu Schweizerrollen oder Würsten geformt und unter dem Mikroskop untersucht. Dieser Videoartikel demonstriert die Gewinnung und Aufbereitung der Kolons in einem Mausmodell der Kolitis.Dieses Verfahren wird im Labor von Dr. Christopher Williams der Abteilung für Krebsbiologie an der Vanderbilt University verwendet, um Kolitis zu untersuchen, bevor die Behandlung mit Dextrinsulfat-Natrium begonnen wird. Während des gesamten Experiments werden Ausgangsgewichte ermittelt. Tägliche Gewichtsbestimmungen erfolgen, nachdem die Mäuse gewogen wurden; man stellt eine 3 %ige (Gewicht pro Volumen) Lösung von Dextrinsulfat-Natriumsalz oder DSS in Wasser her.Das DSS muss ein niedriges Molekulargewicht aufweisen, damit dieses Modell wirksam ist; bereiten Sie ausreichend DSS-Lösung zu, um eine Wasserflasche für jeden Mäusekäfig zu füllen, und filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45-Mikrometer-Celluloseacetat-Filter. Ersetzen Sie die Trinkwasserflasche im Mäusekäfig durch eine Flasche mit 3%iger DSS-Lösung. Falls Ihre Einrichtung ein automatisiertes Bewässerungssystem verwendet, bringen Sie Absperrspitzen an den Wasserspendern an, um sicherzustellen, dass die Mäuse keinen Zugang zu einer anderen Wasserquelle haben.Nach vier Tagen werden die Mäuse erneut gewogen, um systemische Folgen der Kolitis zu quantifizieren. Gewichtsverlust tritt häufig bei schweren Schäden auf, kann jedoch am selben Tag noch nicht sichtbar sein und sich erst einige Tage später zeigen. Am vierten Tag wird die DSS-Lösung durch Wasser ersetzt, um weitere drei Tage lang eine partielle Regeneration des kolorektalen Epithels zu ermöglichen.Drei Tage später, am Tag sieben, werden die Mäuse erneut gewogen. Der Colon kann anschließend von den euthanasierten Mäusen wie im nächsten Abschnitt gezeigt entnommen werden. Um den Colon zu entnehmen, exponieren Sie die ventrale Seite der euthanasierten Maus, um ungehinderten Zugang zum Abdomen sicherzustellen.Befeuchten Sie den Bauch vollständig mit 70 % Ethanol. Greifen Sie die Mittellinie des Bauches mit Gewebepinzetten und heben Sie sie an. Zeltet so die Haut mit feinen Spitzenscheren. Präparieren Sie den Bauch, um die Bauchorgane freizulegen. Verlängern Sie den Schnitt bis zur Spitze des Xiphoidfortsatzes in der Mittellinie und führen Sie ihn dann entlang der unteren Begrenzung der Rippenbögen beidseits fort. Identifizieren Sie Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm.Dissezieren Sie den Dickdarm vorsichtig aus dem umgebenden Mesenterium heraus. Danach durchtrennen Sie den Dickdarm, um ihn tiefer im Becken freizulegen. Den distalen Dickdarm vom Rektum. Es ist darauf zu achten, dass keine Arterien oder Venen durchtrennt werden. Außerdem sollte beachtet werden, dass der Dickdarm leicht einreißen kann. Entfernen Sie den Dickdarm daher vorsichtig vom Mesenterium.Präparieren Sie den Dickdarm am Kolonsekelnrand, um den proximalen Dickdarm zu lösen. Entfernen Sie den Dickdarm vollständig und führen Sie über eine Fütterungsnadel mit 20 Gauge und eine 10-Milliliter-Spritze eine Intubation durch, um den Dickdarm mit eiskaltem PBS zu spülen, bis das EIT vollständig frei von Stuhl ist. Es ist wichtig, die korrekte Orientierung des Dickdarms beizubehalten, indem Sie das distale Ende des Dickdarms stets am nächsten zu sich halten.Messen Sie zunächst die Kolonlänge mithilfe eines digitalen Messschiebers. Die Kolonlänge ist ein weiterer Indikator für die Schwere der Verletzung. Kolitis verstärkt Ödeme und verkürzt die Gesamtlänge des Kolons. An diesem Punkt können die gewonnenen Kolons entweder als Wurst zur makroskopischen Analyse verarbeitet oder als Schweizerrolle zur histologischen Analyse der akuten Kolitis präpariert werden. Wir werden diese Techniken in den folgenden Abschnitten demonstrieren, um das Kolon als Wurst zu verarbeiten. Für die makroskopische Analyse des gesamten Kolons ist es wichtig, die korrekte Orientierung des Kolons beizubehalten. Deshalb halten Sie das distale Ende des Kolons stets in Ihrer Nähe.Schneiden Sie zwei Stücke einer nicht resorbierbaren Naht ab, eines etwa einen Zoll lang und das andere zwei Zoll lang. Verwenden Sie das zwei Zoll lange Nahtstück, um das distale Ende des Kolons so nah wie möglich an den Rand zu ligieren, wobei jedoch eine gute Abdichtung erhalten bleibt. Anschließend wird eine 20-Gauge-Fütterungsnadel, die fünf Milliliter 10 % gepuffertes Formalinphosphat enthält, in das proximale Ende des Kolons eingeführt.Binden Sie das verbleibende Stück Faden unmittelbar proximal zur Birne der Fütterungsnadel locker zu. Greifen Sie nun fest am Kolon an der Birne der Fütterungsnadel und spritzen Sie eine ausreichende Menge Formalin ein, wobei sichergestellt werden muss, dass sich der Kolon ausdehnt. Ziehen Sie den Knoten im Faden fest, während Sie die Fütterungsnadel zurückziehen, sodass der infundierte, aufgeblähte Kolon zurückbleibt.Als Wurst füllen Sie ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen mit 10 % gepuffertem Formalin und Phosphat und beschriften Sie das Röhrchen. Legen Sie den Dickdarm in das Röhrchen und fixieren Sie ihn 24 Stunden lang. Gießen Sie nach 24 Stunden das Formalin in einen geeigneten Abfallbehälter ab und ersetzen Sie es durch 70 %igen Ethanol für weitere 24 Stunden.Das Kolon kann unbegrenzt bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol aufbewahrt werden. Wenn Sie bereit sind, das Kolon zu analysieren, nehmen Sie es aus dem kegelförmigen Reagenzglas heraus. Durchtrennen Sie vorsichtig mit einem Skalpell die Schnüre an beiden Enden, ohne das Kolon zu beschädigen.Beachten Sie, dass das distale Ende das längste Stück Schnur hat. Schneiden Sie den Kolon entlang von distal nach proximal auf, sodass er eine lange Fläche bildet. Der Kolon kann nun unter einem Stereomikroskop betrachtet werden.Schneiden Sie den Dickdarm längs auf und legen Sie ihn als flache Scheibe aus. Das Aufrollen des Dickdarms erfordert zwei Pinzetten und eine zweihändige Technik. Greifen Sie mit den Pinzetten beide seitlichen Ränder des distalen Dickdarmabschnitts und rollen Sie den Dickdarm schrittweise auf, indem Sie die Pinzetten drehen und wieder lösen, bis hin zum proximalen Rand, wodurch sich eine spiralförmige Struktur mit einer dritten Dimension, eine sogenannte „Swiss-Roll“, bildet.Falls der Darm an dem Watman-Papier haftet, befeuchten Sie das Papier und den Darm mit einer kleinen Menge PBS, um die Form zu erhalten. Greifen Sie die Rolle fest mit einer Pinzette und durchtrennen Sie sie mit einer Nadel der Größe 27,5. Sichern Sie die Rolle, indem Sie die Nadel abbiegen, während sie die Rolle verlässt.Legen Sie nun die Probe in ein beschriftetes Gewebekästchen und geben Sie das Kästchen in ein Gefäß mit 10% gepuffertem Formalinphosphat. Lassen Sie es 24 Stunden bei Raumtemperatur, um das Gewebe zu fixieren. Nach 24 Stunden gießen Sie das Formalin ab und ersetzen es durch 70 % Ethanol für zusätzliche vier Stunden.Das Kolon kann unbegrenzt bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol aufbewahrt werden. Dieses Modell ermöglicht es dem Forscher, das Kolon zu gewinnen, zu fixieren und zu analysieren, wodurch die Beurteilung des Schweregrads der Kolitis ermöglicht wird. Für die makroskopische Analyse des gesamten Kolons kann das Kolon wie eine Wurst verarbeitet werden, die mit Formalin infundiert und vollständig aufgebläht wird.Die geöffnete Wurst sollte flach liegen. Wenn die Wurstmethode korrekt durchgeführt wurde, ist der fixierte Colon dilatiert, und die gesamte Mukosaoberfläche kann leicht manipuliert und unter dem Stereomikroskop betrachtet werden. Für die histologische Analyse kann der Colon als Schweizer Rolle aufgearbeitet werden.Die Rolle wird mit einer Nadel fixiert und in eine Gewebekassette zur Fixierung gegeben. Wenn die Rolle geschnitten und auf einen Objektträger aufgebracht wird, sollte sie bei korrekter Durchführung einen repräsentativen Querschnitt des gesamten Kolons ergeben. Schnitte der Schweizer Rolle können mit Hämatin und ASIN gefärbt werden, um das Ausmaß der kolorektalen Schädigung zu bestimmen. Beachten Sie, dass das distale Ende des Kolons in der Mitte der Rolle auf dem Objektträger liegt.In diesem Beispiel sind Entzündungen und Schäden an den Krypten im mit DSS behandelten Kolon im Vergleich zur Wasser-behandelten Kontrolle erkennbar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Kolons aus einem murinen Modell einer akuten Kolitis gewinnt und verarbeitet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie vor der Tötung gut organisiert sind.Die Mäuse haben beispielsweise alle Schläuche und Kassetten, die jeweils für jede Maus gekennzeichnet sind, sowie alle Werkzeuge und Reagenzien griffbereit. Außerdem sollten detaillierte Aufzeichnungen über das Körpergewicht der Mäuse und die Kolonlänge geführt werden. Schließlich muss sichergestellt sein, dass ausreichend Zeit für die Probenaufarbeitung eingeplant wurde.Normalerweise dauert es pro Maus 15 Minuten für eine Anfängerin und sechs bis acht Minuten für jemanden mit mehr Erfahrung in dieser Technik.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem Verabreichung des genotoxischen Agens Azoxymethan (AOM) durch drei Zyklen des pro-entzündliches Mittel Dextransulfat-Natrium (DSS) rasch und konsequent befolgt erzeugt Dickdarmtumoren in Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten mit den in menschlichen ulcerosa angesehen -assoziierten Krebserkrankungen.

Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Generierung eines chemisch induzierten Mausmodells für Colitis — eine entzündliche Darmerkrankung. Die Maus darf eine Dextran-Natriumsulfat (DSS)-Lösung für eine angemessene Dauer zu sich nehmen. Beim Verzehr schädigt DSS die Schleim- und Epithelschichtbarriere im Dickdarm, so dass Darmmikroben in das darunter liegende Gewebe eindringen können – wo sie von den ansässigen Immunzellen wahrgenommen werden, um eine übertriebene Immunantwort zu vermitteln,...

Eine Technik zur Generierung eines Mausmodells für Dextransulfat-Natrium-induzierte Kolitis

Dieses Video zeigt die Hämatoxylin- und Eosin-Färbemethode (H&amp;E) zur Bewertung von Dickdarmschäden in einem Mausmodell der DSS-induzierten Kolitis — einer entzündlichen Darmerkrankung. Nach der Isolierung des Dickdarms von einer DSS-behandelten Maus und der Entnahme von Gewebeschnitten hilft die H&amp;E-Färbung der Schnitte, die entzündungsbedingte Gewebeschädigung zu identifizieren.

Hämatoxylin- und Eosin-Färbung zur Beurteilung von Dickdarmschäden bei DSS-induzierter Kolitis

DNBS / TNBS induzierte Colitis bietet eine alternative und kostengünstige Methode, um die Pathobiologie von entzündlichen Darmerkrankungen zu untersuchen. Die in diesem Papier diskutiert Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von DNBS Colitis bei Mäusen und Ratten zu induzieren, und erlaubt es, Host-Mediated-Darm-Reaktionen gründlich zu studieren.

DNBS / TNBS Colitis-Modelle: Einblicke in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Effekte von Nahrungsfett

Murine distalen Kolostomie bietet ein Mausmodell für menschliche Abzweigung Kolitis, eine vorwiegend lymphozytären Kolitis im Dickdarm-Segment aus dem fäkal Strom ausgeschlossen.

Murine distalen Kolostomie, ein neuartiges Modell Ablenkung Colitis bei C57BL/6 Mäusen

Fehlende Standardisierung für murine Gewebe Verarbeitung reduziert die Qualität der murinen histopathologische Analyse im Vergleich zu menschlichen Exemplare. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur histopathologischen Untersuchung der murinen entzündet und uninflamed Kolon Gewebe auf die Machbarkeit von Robotersystemen routinemäßig verwendet für die Verarbeitung und Einbettung von humanen Proben durchführen.

Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache chirurgische Entfernung des Blinddarms (Kaecal-Patch) in einer Maus, gefolgt von der Induktion von entzündlichem Darmerkrankungen-assoziiertem Dickdarmkrebs. Dieses murine Appendektomie-Modell ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rolle des Blinddarms bei der Pathogenese der menschlichen Magen-Darm-Krankheit.

Murine Appendektomie Modell der chronischen Colitis assoziiert entaktischen Darmkrebs durch präzise Lokalisierung von Caecal Patch

Die systematische Bewertung von Darmentzündungen mit einem freien computergestützten System ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um histopathologische Veränderungen in Kolitismodellen, die durch das Vorhandensein von Geschwüren und entzündlichen Veränderungen gekennzeichnet sind, quantitativ zu vergleichen. Die auswertung der histologischen Colitis-Score-Bewertung stärkt klinische Beobachtungen und erleichtert die Dateninterpretation.

Systematische Scoring-Analyse für Darmentzündungen in einem Murine Dextran Natriumsulfat-induzierte Colitis Modell

Charles Taylor und John Marshall erläutern den Nutzen der mathematischen Modellierung zur Bewertung der Wirksamkeit der Bevölkerung Ersatz-Strategie. Insight ist in, wie Rechenmodelle können Informationen über die Populationsdynamik von Moskitos und die Ausbreitung von Transposons durch A. gambiae Unterarten eingeräumt werden. Die ethischen Überlegungen der Freisetzung von gentechnisch veränderten Moskitos in die freie Wildbahn werden diskutiert.

Die Vorhersage der Wirksamkeit der Bevölkerung Replacement-Strategie mittels mathematischer Modellierung

Lernen Sie die Induktion akuter Kolitis bei Mäusen mit Dextransulfat-Natrium (DSS) im Trinkwasser. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare histologische Analysen des Dickdarms.

Murine Colitis Modeling mit Dextransulfat Sodium (DSS)

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