Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die optimalen Elektroporationsbedingungen für die Transfektion primärer Zelllinien unter Verwendung von embryonalen Mausfibroblasten oder mfs zu ermitteln. Als Beispiel werden MF-Zellen und die gewünschte Nukleinsäure in eine 96-Well-Elektroporationsplatte geladen, die an das Gene Pulser MX Cell-System angeschlossen ist und es ermöglicht, mehrere Elektroporationsbedingungen in einem einzigen Durchlauf zu testen. Bei Optimierungsexperimenten werden die Zellen nach der Elektroporation kultiviert und hinsichtlich der Transfektionseffizienz analysiert.

Mithilfe der epifluoreszenten Mikroskopie und der Durchflusszytometrie können anschließend die effizientesten Elektroporationsbedingungen für zukünftige Transfektionen ausgewählt werden. Hallo, ich bin Adam McCoy, leitender Wissenschaftler in der Abteilung für Genexpression bei BioRad Laboratories. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem sich die besten Elektroporationsbedingungen für die Transfektion primärer Zelllinien einfach identifizieren lassen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Genexpression in diesen Zellen zu untersuchen. Heute werde ich drei verschiedene Passagezahlen von Mes- oder murinen embryonalen Fibroblasten verwenden. Ich verwende Kulturen mit unterschiedlichen Passagezahlen aus zwei Gründen.

Zunächst werde ich zeigen, wie wichtig die Zellgesundheit ist: Bei primären Zelllinien kann bereits ein paar zusätzliche Tage in der Kultur einen Unterschied für die Transfektionseffizienz bedeuten. Zweitens möchte ich zeigen, dass der Prozess zur Bestimmung der optimalen Bedingungen derselbe bleibt, auch wenn die Transfektionseffizienz bei älteren Zellen abnimmt. Wahrscheinlich umfasst Ihr Experiment keine Zellen unterschiedlichen Alters.

Sie können das gleiche Verfahren mit Ihrem eigenen experimentellen Design durchführen. Wenn Sie die Genexpression in Kontroll- und behandelten Zellen vergleichen möchten, können Sie zunächst die optimalen Bedingungen ermitteln und dann Ihr Experiment unter Verwendung der identifizierten Bedingungen durchführen. Alternativ können Sie die Optimierung und das Experiment gemeinsam durchführen.

Wie ich heute demonstrieren werde, verwende ich ein GFP-kodierendes Plasmid, um die Transfektionseffizienz mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Das Elektroporationsverfahren wäre jedoch dasselbe, auch wenn Sie etwas anderes tun, beispielsweise irna einführen und die Genexpression mittels Echtzeit-PCR analysieren. Beginnen wir also.

Die in diesem Protokoll verwendeten embryonalen Mausfibroblasten oder Mets sind adhärente Zellen. Daher besteht der erste Schritt bei der Arbeit mit diesen Zellen darin, sie mithilfe standardmäßiger Zellkulturprotokolle unter Verwendung der Trypsinisierung vom Boden des Kolbens zu lösen. Nachdem sich die Zellen vom Kolben gelöst haben, neutralisieren Sie die Trypsinlösung mit Medium, das Serum enthält, und sammeln die Zellen in 50-Milliliter-Konischen Röhrchen.

Nach dem Sammeln zentrifugieren Sie die Zellen, nachdem sie pelletiert wurden. Sie sollten gewaschen werden, indem Sie sie in einem bekannten Volumen PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen, nachdem sie vollständig resuspendiert wurden, wobei berücksichtigt werden muss, dass für Elektroporationsversuche eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter benötigt wird.

Berechnen Sie die entsprechende Anzahl an Zellen basierend auf der Zellzahl und überführen Sie sie in ein sauberes Gefäß. Zentrifugieren Sie, um die Zellen besser zu pelletieren. Entfernen Sie dann vorsichtig das Überstand.

Suspendieren Sie die Zellen in Elektroporationspuffer mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und geben Sie 20 Mikrogramm pro Milliliter des Plasmids hinzu. Die Platten sind in 96 Vertiefungen unterteilt, wobei die Spalten von eins bis 12 und die Reihen von A bis H beschriftet sind. Jeder Satz von vier Vertiefungen, oder Vertiefungs-Set, teilt ein Paar Elektrodenplatten, sodass die Zellen in diesen Vertiefungen denselben Impuls erfahren. Beispielsweise sind die Zellen 1A, 1B, 1C und 1D elektrisch verbunden in einem einzigen Vertiefungs-Set und würden alle denselben Impuls erhalten.

Der nächste Satz von vier Vertiefungen – A, B, C und D – erhält alle den zweiten Impuls, sobald das Protokoll gestartet wird. Obwohl die Parameter identisch sein können, ist die 96-Loch-Elektroporationsplatte so konzipiert, dass die obere und untere Hälfte der Platte getrennt sind. So erhalten die Vertiefungen E, F, G und H im unteren Teil der Platte einen Impuls, der sich jedoch von dem Impuls unterscheidet, den die Vertiefungen A, B, C und D im oberen Teil der Platte erhalten.

In diesem Experiment wird nur die Hälfte der Platte verwendet. Die ersten drei Vertiefungen jedes Vertiefungssatzes enthalten Zellen unterschiedlichen Alters. Die Zellen in der oberen Reihe, Reihe A, wurden fünfmal passagiert.

Die Zellen in Reihe B wurden neunmal und die Zellen in Reihe C wurden 13-mal passagiert. Reihe D enthält vor der Elektroporation lediglich Elektroporationspuffer. Es ist ratsam, Ihren Protokollablauf zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Einstellungen korrekt sind.

Dieses Protokoll liefert sechs exponentiell abfallende Pulse, gefolgt von sechs Rechteckimpulsen. Die exponentiell abfallenden Pulse steigen von 200 Volt auf 450 Volt an und verwenden jeweils nur 350 Mikrowiesel. Aufgrund des geringen Widerstands des verwendeten Genpuls- oder Elektroporationspuffers.

Die Rechteckwellenimpulse variieren sowohl in der Spannung als auch in der Impulsdauer. Die Kapazitätseinstellung des Geräts muss an die Leitfähigkeit der Elektroporationsmischung angepasst werden. Wenn ein Puffer mit höherem Widerstand für die Elektroporation verwendet wird, beispielsweise DMEM, kann der gleiche Spannungsbereich verwendet werden, jedoch mit einer größeren Kapazität, wie beispielsweise 950 Mikrofarad für die exponentiell abfallenden Impulse.

Wenn die optimale Kapazität des verwendeten Puffers nicht bekannt ist, müssen Sie auch die Kapazität bei den getesteten Elektroporationsbedingungen variieren. Als Nächstes füllen Sie 150 Mikroliter Zell-Plasmid-Mischung in jedes verwendete Loch. Das vierte Loch jedes verwendeten Lochsatzes wird mit Elektroporationspuffer gefüllt.

Nach dem Beladen der Platte diese in die MXL-Plattenkammer einsetzen und den Deckel schließen. Anschließend den Puls-Taste drücken, um die Zellen zu elektroporieren. Der Elektroporator gibt elektrische Impulse nacheinander in jede Vertiefung gemäß den in dem gewählten Protokoll festgelegten Bedingungen ab.

Das Elektroporation aller Zellen dauert nur wenige Sekunden. Sobald der Impuls abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus der Plattenkammer des Mixgeräts. Überführen Sie die Zellen aus jedem Wells in eine Kulturschale, die vorgewärmtes Kulturmedium enthält.

Diese Zellen werden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, kultiviert. Kontrollproben, die nicht elektroporiert wurden, werden aus der verbleibenden Zell-Plasmid-Mischung entnommen und in Kulturschalen mit der Vorwärmekultur gegeben. Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie das der elektroporierten Zellen. Zum Schluss vorsichtig schwenken.

Dann klopfen Sie leicht auf die Platte, um die Zellen zu verteilen, bevor Sie diese für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator stellen, um anschließend die Transfektionseffizienz zu analysieren und die für Ihr Experiment besten Elektroporationsbedingungen zu ermitteln. Sobald die optimalen Elektroporationsbedingungen identifiziert wurden, stehen für zukünftige Experimente zwei Elektroporationsmethoden zur Auswahl. Der Forscher kann entweder weiterhin Zellen in 96-Well-Platten elektroporieren oder Zellen nacheinander in Küvetten elektroporieren.

Küvetten können jeweils nur eine Probe aufnehmen und benötigen das Vierfache des Volumens, das für ein Loch einer 96-Loch-Platte erforderlich ist; einzelne Küvetten sind jedoch kostengünstiger und einfach zu handhaben, wenn nur eine geringe Anzahl von Proben benötigt wird. Das Gene-Pulse- oder MX-Cell-System ist so konzipiert, dass man diesmal dieselben Elektroporations-Einstellungen sowohl für die Platten als auch für die Küvetten verwenden kann. Verwenden Sie anstelle der Plattenkammer den MXL-Shock-Pod für Küvetten.

Trennen Sie die Plattenkammer von der Rückseite des Geräts und schließen Sie die Schockkammer an. Da die Schockkammer nur den für die Brunnenreihe A, B, C, D programmierten Impuls abgibt, muss möglicherweise ein anderes Programm ausgewählt werden. Um ein zuvor gespeichertes Programm auszuwählen, drücken Sie auf „Home“.

Danach Option drei „Benutzerprotokolle“ auswählen. Befinden Sie sich bereits im richtigen Benutzerverzeichnis, drücken Sie die Eingabetaste, um die Benutzerprotokolle auszuwählen, und scrollen Sie nach unten. Um das richtige Programm hervorzuheben, drücken Sie die Eingabetaste, um dieses Programm auszuwählen.

Das Instrument ist nun bereit. Nachdem das Programm ausgewählt wurde, bereiten Sie die Küvetten vor. Die Mischung aus Plasmid und MEFs wird genauso hergestellt wie zuvor gezeigt.

Beladen Sie jede 0,4 cm lange Vet mit dem gleichen Volumen, das für einen gesamten Brunnen-Satz verwendet wurde, in den 96-Loch-Platten. Da ein Brunnen-Satz aus vier Brunnen besteht und pro Brunnen 150 µL Puffer oder Zellgemisch verwendet wurden, wurden 600 µL des Plasmid-Zellgemischs pro Vet angewendet.

Als Nächstes geben Sie den Vektor in die Kammer der Schockkapsel, drücken Sie „Puls“, um den elektrischen Schock an die Zellen abzugeben. Nach der Elektroporation fahren Sie wie bei der Plattenmethode fort: Mischen Sie die Zellen und überführen Sie Aliquots in Zellkulturschalen, die mit vorgewärmtem Medium gefüllt sind, sowie in Kontrollbrüchen. Bei den Brüchen, die nicht elektroporiert wurden, schwenken Sie die Schale und klopfen leicht darauf.

Anschießend die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, um sie nach der Transfektion zur Regeneration zu bringen, bevor die Transfektionseffizienz analysiert wird. Die Transfektionseffizienz qualitativ mittels epifluoreszenzmikroskopischer Bildgebung und quantitativ mittels Durchflusszytometrie analysieren. Zellen, die erfolgreich elektroporiert wurden und nun das GFP-Gen exprimieren, erscheinen unter epifluoreszenzmikroskopischer Betrachtung grün; hier ist ein typisches, erfolgreiches Ergebnis dargestellt. Die Betrachtung der Zellen im Phasenkontrast ermöglicht die Visualisierung sowohl transfizierter als auch nicht transfizierter Zellen.

Hier sind die Zellen dargestellt, die dem Elektroporationspuls mit der niedrigsten Spannung bei 200 Volt ausgesetzt wurden. Die Zellen sind aufgrund der hohen Zelldichte weitgehend konfluent. Dasselbe Sichtfeld unter Epifluoreszenz zeigt, dass eine Anzahl von Zellen den GFP-Marker exprimiert, dies jedoch nur ein geringer Prozentsatz der Zellen ist, die im vorherigen Bild bei 250 Volt sichtbar waren.

Die Gesamtzahl der unter Phasenkontrast sichtbaren lebenden Zellen nimmt unter Epifluoreszenz leicht ab. Wir können erkennen, dass die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen bei der höchsten angelegten Spannung – 375 Volt – zugenommen hat. Es sind zwar weniger lebende Zellen sichtbar, jedoch exprimiert ein großer Anteil der verbleibenden Zellen GFP.

Welche Bedingung optimal ist, hängt vom experimentellen Design ab. Bei manchen Experimenten könnte die größte Anzahl transfizierter Zellen am günstigsten sein. Bei anderen Experimenten ist dagegen der höchste Transfektionsprozentsatz am besten.

Wir interessieren uns für den Prozentsatz der Zellen, die unter jeder Bedingung GFP-positiv sind, und dafür, wie sich die Prozentsätze mit dem zellulären Alterfluss ändern. Die Zytometrie kann quantitative Informationen über die Transfektionsergebnisse unter den verschiedenen Elektroporationsbedingungen liefern. Hier dargestellt ist der Prozentsatz der Zellen, die im jeweiligen Passagierungsabschnitt GFP-positiv sind.

Fünf Zellen. Unter jeder der 12 Elektroporationsbedingungen betrug der maximale Transfektionsprozentsatz unter dem exponentiellen Spannungsabfall mit der höchsten Spannung etwa 80 %. Pulsbedingung sechs und 70 unter dem stärksten getesteten Rechteckpuls, Bedingung 12, wobei die Zellen neunmal vor der Elektroporation passiert wurden.

Das allgemeine Muster des Transfektionsanteils ist nahezu identisch, jedoch mit einer sehr leichten Abnahme der angezeigten Transfektionsraten. Hier sind die Anteile an GFP-Zellen in den Zellen der Passage 13, die eine deutliche Verringerung der Transfektionsrate im Vergleich zu den jüngeren Zellen aufweisen. Die höchsten Transfektionsraten lagen bei etwa der Hälfte dessen, was mit den jüngeren Zellen erreicht wurde, was die Bedeutung der Verwendung gesunder Zellen so bald wie möglich nach der Isolierung verdeutlicht.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie das MXL-Elektroporationssystem verwenden, um die optimalen Bedingungen für elektroporierende Karten oder andere primäre Zelllinien zu ermitteln. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, gesunde Zellen möglichst bald nach der Isolierung zu verwenden und Elektroporationsbedingungen zu wählen, die auf den Elektroporationspuffer abgestimmt sind. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.