Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Hallo, ich bin Mark Parker. Willkommen im Eaton Peabody Laboratory im Massachusetts Eye and Ear Infirmary in Boston, Massachusetts. Heute stellen wir ein Protokoll für die Isolierung und Primärkultur des marinen Organs von kti vor.

Dieses Protokoll ist für unsere Arbeit von grundlegender Bedeutung, da es die In-vitro-Analyse des für das Hören unerlässlichen Organs ermöglicht. Um den Nutzen dieses Ansatzes hervorzuheben, werden wir auch eine der vielen Anwendungen der Organe in unserem Labor demonstrieren, die Elektroporation von exogenen Genen in die kultivierten Explantate. Lasst uns an die Arbeit gehen.

Die Gliederung dieses Verfahrens ist wie folgt: Neugeborene Mäuse werden geköpft und ihre Schläfenknochen durch stumpfe Dissektion entfernt. Anschließend wird die Cochlea durch stumpfe Dissektion aus dem Schläfenbein isoliert. Anschließend wird das knöcherne Labyrinth der Cochlea mit einer Pinzette geöffnet und das Spiralband aus dem inneren Modis der Cochlea entfernt.

Schließlich wird das Spiralband mit einer Pinzette vom Corde-Organ getrennt, durchscheinende Rosen der Haarzellen sind zu sehen, die über die gesamte Länge des Kti-Organs verlaufen. Ein Teil der Membran des RISE, der bei der Entfernung des Spiralbandes gerissen wurde, verläuft über die gesamte Länge der modularen Seite. Als Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens werden Kord-Explantate 24 Stunden lang kultiviert und dann mit einem exogenen fluoreszierenden Reportergen elektroporiert

Die ersten Schritte dieses Verfahrens umfassen die Vorbereitung der Kulturplatten. Legen Sie einen sterilisierten Glasdeckglas, der in 70 % Ethanol gelagert wurde, in zwei Vertiefungen einer vorsterilisierten Kulturschale mit vier Ringzellen. Die Verwendung von nur zwei der vier Vertiefungen begrenzt die Zeit, die die Kulturen aus dem Inkubatorbehälter herauskommen.

Der Deckschirm wird mit der Lösung bestehend aus Eins-zu-Eins-Poly-Ornithin und Laminin aufgeschoben. Ergänzt mit 20 % fötalem Rinderserum, stellen Sie die Kulturschale in eine größere 10 Zentimeter große Schale, um den Transfer zu erleichtern, und inkubieren Sie dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zum Schluss schneiden Sie die Werkzeuge über Nacht in einem 150 Grad Celsius heißen Inkubator.

Sterilisieren Sie die Positivstrom-Dissektionshaube, indem Sie das UV-Licht 20 Minuten vor Beginn der Dissektion einschalten. Sterilisieren Sie den Arbeitsbereich innerhalb der Präparierhaube, indem Sie alle Oberflächen mit 70 % Ethanol besprühen. Legen Sie den Kopf eines enthaupteten Mäusewelpen in eine Petrischale, die 70% Ethanol enthält, und entfernen Sie dann die Epidermis mit einer Skalpellklinge.

Öffnen Sie den Schädel entlang der sagittalen Naht mit einer Skalpellklinge und halbieren Sie dann das Gehirn. Bewahren Sie das verhätschelte Vorderhirn für die weitere Dissektion auf. Entfernen Sie das Vorderhirn, das Kleinhirn und den Hirnstamm durch stumpfe Dissektion.

Man beachte die Lage des parametallförmigen Schläfenbeins auf der unteren lateralen Seite des Schädels. Übertragen Sie die TAL-Knochen in eine drei Millimeter große Schale mit steriler Haks Kugelsalzlösung. Die restliche Dissektion ist unter einem Präpariermikroskop durchzuführen.

Entfernen Sie umliegendes Gewebe aus dem Schläfenbein. Lokalisieren Sie die muschelförmige Cochlea und entfernen Sie sie mit einer Pinzette aus dem vestibulären System. In diesem Entwicklungsstadium ist das knöcherne Labyrinth noch nicht vollständig verkalkt und lässt sich leicht zerlegen.

Entfernen Sie das knöcherne Labyrinth der Cochlea durch vorsichtige Trennung, beginnend am basalen Ende und apikal bewegend. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Spiralband und das daran befestigte sensorische Epithel aus dem Modis, indem Sie es mit einer Pinzette an der Hakenregion der Basis befestigen und abwickeln. Während Sie die Spirale von der Basis aus bewegen, entfernen Sie das spiralförmige Band mit einer feinen Pinzette Nummer 55 aus dem sensorischen Epithel.

In einigen unserer Versuche ist die Entfernung des spiralförmigen Limbus aus dem sensorischen Epithel erwünscht. Bei diesem Mikro-Ol-Isolat-Verfahren wird das Organ des Cordi aus dem spiralförmigen Limbus isoliert, wobei zwei halbe cc-Insulinspritzen als Pinzetten verwendet werden. Zuerst wird die Hakenregion des Organstrangs mit Hilfe der Insulinspritzen entfernt.

Als nächstes wird der spiralförmige Limbus von der Reihe der inneren Haarzellen getrennt, die an der Spitze beginnt und basal entweder das gesamte Corte-Organ mit dem daran befestigten spiralförmigen Limbus verläuft. Das mikroisolierte sensorische Epithel oder der mikroisolierte Spirallimbus kann wie folgt kultiviert werden: Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus den Kulturvertiefungen und ersetzen Sie sie durch 130 Mikroliter Kulturmedium, das 10 % Serumtransfer enthält, das präparierte Organ der Corde auf den beschichteten Glasabdeckschlüpfer in der Kultur. Nun, wir haben festgestellt, dass die folgenden Techniken dazu beitragen, dass das Corti-Organ nicht in den Nährmedien schwimmt, sondern auf dem Deckglas haftet.

Beim ersten Anstrich rutscht die Glasabdeckung wie beschrieben. Entfernen Sie zweitens das Medium, um das Explan auf der beschichteten Schale zu befestigen. Dadurch wird der Kontakt zwischen der Kulturschale und dem X-Plan sichergestellt.

Drittens, richten Sie den Explan so aus, dass die Flimmerhärchen der Haarzellen nach oben zeigen. Diese Ausrichtung erleichtert die Einhaltung des Plans an der kultivierten Schale. Zum Schluss fügen Sie 130 Mikroliter Serumnährmedien mit einer 200-Mikroliter-Pipette hinzu, indem Sie vorsichtig zwei Tropfen auf die Oberfläche des Organakkords tropfen und dann langsam das verbleibende Volumen an der Seite der Vertiefung hinzufügen, den Explan vorsichtig in einen Inkubator bringen und dann bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5% Kohlendioxid inkubieren.

Diese Kulturen können sieben bis 10 Tage lang aufbewahrt werden. Es gibt zahlreiche Anwendungen für das isolierte Organ der Kern-T. Einige Beispiele sind die Analyse der Genexpression mittels R-T-P-C-R oder NC-2-Hybridisierung, Organe der Kortikokultur mit Spiralganglienzellen oder exogenen Stammzellen oder die in vitro Analyse des Haarzelltods. Um den Nutzen dieses Verfahrens zu demonstrieren, zeigen wir Ihnen eine Technik, die in unserem Labor häufig verwendet wird, um exogene Gene in den Explankulturen zu exprimieren.

Für diese Demonstration wird das isolierte Organ des Cortis eine Elektroparade mit einem Expressionsvektor sein, der konstitutiv das rote Reportergen DS exprimiert. Nach der Elektroporation werden die Kulturen 24 Stunden lang mit einem Transfektionsreagenz aus dem sechsten Gen inkubiert, um das Transfektionsverfahren zu verbessern. Mit diesem System weisen die transfizierten Zellen innerhalb von 24 Stunden eine zytoplasmatische rote Fluoreszenz auf.

Bereiten Sie zunächst ein Verhältnis von drei zu zwei Transfektionsreagenzien des FU-Gens 6 zur Ziel-DNA in einem drei Milliliter Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden vor. Entfernen Sie in einer Laminar-Flow-Haube die Nährmedien aus dem Gartenbauorgan. Fügen Sie eine Minute lang 130 Mikroliter Wasser hinzu und entfernen Sie es dann mit einer Pipette mit einem Fassungsvermögen von 200 Mikrolitern.

Fügen Sie als nächstes 30 Mikroliter DS-Rot-Reporter-Plasmid hinzu, das in einer Stammlösung von zwei Milligramm Plasmid-DNA pro Milliliter Wasser gelagert wird. Für die Elektroporation verwenden wir ein BioRad-Gen Pulser Excel, um den elektrischen Impuls zu erzeugen. Die Elektroden wurden von unserer Maschinenwerkstatt an unsere Zwecke angepasst, die Elektroden bestehen aus blankem Draht, der in einem 90-Grad-Winkel gebogen und in eine Paddelform gecrimpt wurde.

Schieben Sie die Elektroden des Elektros mit einem Mikromanipulator vor, so dass sich Anode und Kathode auf beiden Seiten der Kultur befinden. Erzeugen Sie 10 Impulsfolgen bestehend aus 27 Volt und 30 Millisekunden Dauer, um das Reportergen in das Organ zu elektroreinigen. Warten Sie dann fünf Minuten.

Fügen Sie als nächstes 130 Mikroliter der DNA-Lösung des FU-Gens sechs zum Explan hinzu und inkubieren Sie dann über Nacht bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag geben Sie zwei Milliliter Serum in die Kultur, Medien in jede Platte. Die Explan-Kulturen können nach 24 Stunden sechs oder mehr Tage aufbewahrt werden.

Transfizierte Zellen können mit einem SI-Drei-Filter an einem Epi-Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Wir haben Ihnen gerade eine Methode zur Isolierung und primären Kultur des Organs Corte gezeigt. Diese Methode funktioniert mit Mäusen, die bereits am 16. Tag des Embryos bis zum Tag nach der Geburt sind, wenn die Cochlea ausreichend verkalkt ist, um die Dissektion umständlich zu machen.

Darüber hinaus haben wir eine Methode zur Expression exogener Gene in das kultivierte Organ der Corde demonstriert. Dies ist ein Beispiel für eine Art von Experiment, das mit dem kultivierten Explan durchgeführt werden kann. Zweifellos gibt es eine Vielzahl von Anwendungen für diese Technik.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.