Name: Magnetic Resonance Spectroscopy von Live- Drosophila melanogaster Verwendung von Magic Angle Spinning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung von HRMAS 1H-MRS zur molekularen Charakterisierung lebender Drosophila melanogaster. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in metabolische Prozesse des Modellorganismus.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch einen National Institutes of Health (NIH) gewähren AI063433 zu Laurence G. Rahme, ein National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, Direktor der unterstützten der NMR-Kern) und eine Shriner Hospital for Children Forschungsstipendium (# 8893) an A. Aria Tzika. Wir danken Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. für die Unterstützung in den ersten Phasen der Entwicklung dieses Protokolls und Ovidiu C. Andronesi Ph.D. für die Unterstützung bei der TOBSY Pulssequenz.

Teil 1: Vorbereiten Drosophila für HR-MAS-Messungen <ol><li> Verwendung von Standard flylab Verfahren 1, sammeln neu schlüpfende Fliegen für 3 Tage und sie auf Flaschen mit frischen Lebensmitteln zu fliegen fliegen. Inkubieren Sie die gesammelten Fliegen für 5 Tage, so dass die Fliegen wird 5-8 Tage alt just vor dem Experiment. Nur ein Geschlecht (meist Männer) ist für Experimente verwendet. </li><li> Verwenden Sie gesunden, fliegt intakten Wildtyp mit behandelten zB traumatisierte oder genetisch veränderte fliegt 1 zu vergleichen. </li><li> Legen Sie einzelne fliegt in 2ml Röhrchen mit einem Stück (~ 0,2 ml) von essen fliegen 24 Stunden vor dem Experiment. Diese Rohre tragen ein Loch in das Rohr Tasse erfolgt über eine Flamme erwärmt Insulin Nadel. </li><li> Wiegen Sie die Rohre unmittelbar vor und nach der Fliege Einsetzen mit einer hohen Präzision Balance definieren und jeder fliegen s Gewicht durch Subtraktion der erste Wert aus der zweiten. Ein einzelnes Männchen fliegen wiegt in der Regel 0,7-1 mg. </li></ol> Teil 2: HR-MAS-Rotor Vorbereitung. <ol><li> Legen Sie eine einzelne Röhre auf Eis weniger als einer Minute auf die Fliege im Inneren zu betäuben. </li><li> Lay the fly auf einer Schicht aus Aluminiumfolie auf Eis gelegt, und drücken Sie die Fliege sanft in die halbkugelförmigen Hohlraum des NMR Rotoreinsatz mit einer weichen Bürste in Anspruch zu fliegen Einstecken zu gewährleisten bei gleichzeitiger Vermeidung fliegen Verletzungen. </li><li> Platzieren Sie den Einsatz in der Zirkonoxid (ZrO 2) Rotor Rohr (4 mm Durchmesser, 50 ul), um die Fliegen zwischen den Rotor einlegen und den Boden des Rotors (siehe Abbildung 1) zu finden. </li><li> Schließen Sie den Einsatz mit einer Schraube und bedecken Sie es mit Parafilm (siehe Abbildung 1), um den Kontakt zwischen dem Fliegen und der TSP-Standardlösung (TSP zu verhindern: trimethylsilyl-Propionsäure-2 ,2,3,3-d4-säure, Mw = 172, δ = 0,00 ppm, 50 mM in deuteriertem Wasser-D 2 O, diese Funktion als Referenz für beide Resonanz chemische Verschiebung und Quantifizierung). </li><li> Add 8 ul TSP-Standardlösung auf der Oberseite des Rotors einzufügen. (Siehe Abbildung 1). </li><li> Sichere und ziehen das ganze bis in die Rotoren mit einer Kappe (siehe Abbildung 1). </li></ol> Teil 3: HR-MAS-Datenerfassung <ol><li> Einführung des Rotors in die HR-MAS-Sonde und positionieren Sie es im magischen Winkel 54,7 ° (siehe Abbildung 1). </li><li> Stellen Sie die Temperatur um 4 ° C durch einen BTO-2000-Einheit in Kombination mit dem MAS Pneumatikeinheit. Fliegen sind bei 4 ° C, während in das Spektrometer Anästhesie beizubehalten gehalten. </li><li> Stellen Sie die HR-MAS-1 H MRS Spinngeschwindigkeit bei 2 kHz MAS. </li><li> Stabilisieren Sie die MAS Drehfrequenz bei 2,0 ± 0,001 kHz mit einem MAS Drehzahlregler (Drehfrequenz). </li><li> Für Magnet Zubereitung: Melodie und passen die Spule für optimale Leistung und Shim der Magnet für die optimale Qualität der Spektren. </li><li> Erwerben Sie eindimensionalen 1 H-Spektren mit Rotor synchronisiert Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) Spin-Echo-Pulssequenz 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-Übernahme], die als T 2 Filter werden Entfernen Sie die spektrale Verbreiterung 1 H-NMR-Spektren single-fly zu erwerbenden eindimensionale Daten zu allen Proben. Synchronisieren Sie die inter-Puls-Verzögerung (τ = 500μs), um die MAS Drehfrequenz (2 kHz). Legen Sie die Anzahl von Transienten bei 256 mit 32.768 (32k) Datenpunkten. Acquisition Zeit 9 min. </li><li> Erwerben Sie zweidimensionale (2D) 1 H-1 H HR-MAS-NMR-Spektren single-fly bei allen Proben mit einem TOBSY Sequenz mit adiabatischer Impulse 3. Acquisition Parameter sind: 2k Datenpunkte direkten Dimension (11 ppm spektrale Breite), 1 s Wasser pre-Sättigung während des Relaxationsdelay, 8 Scans pro Inkrement, 128 Stufen, 2 s insgesamt Wiederholzeit, 45 ms Mischzeit und insgesamt Übernahme Zeit von 29 min. </li></ol> Teil 4: Data Processing / Analyse <ol><li> Analysieren Sie die MRspectra von Proben mit MestReC Software (Mestrelab Research, www.mestrec.com) </li><li> Verwenden Sie eine Linienverbreiterung Apodizierungsfunktion von 0,5 Hz und gelten für alle HR-MAS-1 H FIDs vor der Fourier-Transformation. </li><li> Verweisen Sie auf die MR-Spektren in Bezug auf δ = 0,0 ppm (externer Standard) TSP. </li><li> Phase-Spektren manuell und wenden Sie einen Whittaker Baseline Schätzer der breiten Komponenten der Ausgangswert vor den Peakfläche Berechnungen subtrahieren. </li><li> Estimate Peakflächen mit MestReC Software. Scale-Peakhöhen in Bezug auf für jede erworbene Spektrum (TSP peak height = 1) TSP. Verwenden Sie t-Tests (zweiseitig, p &lt;0,05), um innerhalb der Gruppe, zwischen Gruppen-Kennzahlen zu vergleichen. </li><li> 2D TOBSY Prozessparameter sind: QSINE = 2 Fenster-Funktion in beiden Dimensionen, FT mit 2k Punkte in der direkten Dimension und Null-Füllung auf 1k in der zweiten Dimension, Phasenkorrektur in beiden Dimensionen und Baseline-Korrektur in der zweiten Dimension. </li><li> Produzieren Sie das 2D-Spektren mit Sparky Programm (TD Goddard und DG Kneller, SPARKY 3, USCF, <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/</a>home / sparky /) </li></ol> Teil 5: Repräsentative Spectra von Live Drosophila melanogaster Flies Die oben beschriebenen Verfahren erlauben eine reproduzierbare Spektren von lebenden Drosophila melanogaster Fliegen zu sammeln. Abbildungen 2 und 3 zeigen repräsentative MR-Spektren in Wildtyp-(wt) Oregon-R erworben Fliegen. Abbildung 2 zeigt 1D 1 H HR-MAS-Spektren CPMG. Auftraggeber Lipidkomponenten [C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C H = C H (5,33 ppm)], Glycerin (1,3-C H 4,10 ppm und 4,30 ppm; 2-CH 2 5,24 ppm), und kleine Metaboliten: β-Alanin (β-Ala wurden 2,57 ppm), Acetat (Ac, 1,97 ppm), phosphocholin (PC, 3,22 ppm) und phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) erkannt und zugeordnet in Übereinstimmung mit früheren Berichten 4, 5. Signale bei 2,02 ppm wurden Methylenprotonen der C H2-CH = CH-Einheit von einfach ungesättigten Fettsäuren (zB Palmitoleinsäure) zugeordnet. Die ungesättigten Säuren wurden durch ein Signal am 5,33 ppm durch Protonen der-CH = CH-Einheit produziert identifiziert. Kleine Metaboliten, die nicht zugeordnet werden konnten oder nicht sichtbar waren mit dem 1D-Spektrum wurden unter Verwendung von 2D-1 H-1 H TOBSY HR-MAS (siehe Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Versuchsaufbau aus in vivo HR-MAS-1H MRS für die Untersuchung von lebenden Drosophila mit 14,1 T. Externer Standard trimethylsilyl-Propionsäure-2 ,2,3,3-d4 Säure in deuteriertem Wasser (TSP / D 2 O). Auf dem Platz: Rotorlage um den magischen Winkel in HR-MAS-Sonde. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. In-vivo-1D HR-MAS-1 H CPMG Spektren von einer Live-Drosophila melanogaster wt fliegen. Lipid-Komponenten: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), Acetat (Ac), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), β-Alanin (β-Ala), phosphocholin (PC) und phophoetanolamine (PE), Glycerin (1,3-C H 4,10, 4,30 ppm; 2-C H 2 5,22 ppm) , C H = C H (5,33 ppm). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. In vivo 2D-1H-1H TOBSY HR-MAS-Spektrum von einer Live-Drosophila melanogaster wt fliegen mit 14,1 T. Klein Metaboliten und Lipid-Komponenten wurden identifiziert. Metaboliten: Alanin (Ala), β-Alanin (β-Ala), Arginin (Arg), Glutamin (Gln), Glutamat (Glu), PC phosphocholin (PC), phophoetanolamine (PE), Taurin (Tau), α-Glucose (α-Glc) und Glycerin. Lipids Komponenten: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (1,33 ppm), C H 2 C-CO (1,58 ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C H = C H (5,33 ppm).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Massachusetts General Hospital Institutional Animal Research Review Board Ausschusses durchgeführt.

Mit Ausnahme des jüngsten Berichts über die Durchführbarkeit der in-vivo-MRT in Fruchtfliegen 6 haben in vivo MRS-Studien in Drosophila noch nicht berichtet worden. In der vorliegenden Protokoll, beschreiben wir die Implementierung eines neuartigen In-vivo-HR-MAS-1 H-MRS-Ansatz zum Nachweis von biologisch wichtigen Molekülen. Insbesondere wiesen wir Lipiden und kleinen Metaboliten in lebenden Drosophila-Fliegen mit 14,1 T in etwa 45 min, die eine angemes...

<table><tbody><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Säure</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Saccharose, Hefe, Maismehl</td><td>Lebensmittel</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oregon RS- oder Canton-S-Fliegen</td><td>Adulte Fliegenlinien</td><td>Bloomington-Stammsammlungszentrum</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td>(Gerät 0)</td></tr><tr><td>2-ml-Röhrchen</td><td>Geräte</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Fliegeninkubatoren</td><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td>hohe Luftfeuchtigkeitskapazität (60–75 %), einstellbare Temperatur und ein 12-h-:12-h-Licht-:Dunkel-Wechsel.</td></tr><tr><td>Bruker Bio-Spin Avance NMR-Spektrometer (600,13 MHz) 4-mm-Dreifachresonanz (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) HRMAS-Probe </td><td>Ausrüstung</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTO-2000-Gerät in Kombination mit einer MAS-Pneumatikeinheit</td><td>Geräte</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mm Zirkoniumdioxid-Rotor (Kapazität 50 µl)</td><td>Ausrüstung</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (Bruker-Speicher)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>Software</td><td></td><td></td><td>Analyse von 1D-NMR-Spektren&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>Software</td><td></td><td></td><td>2D-NMR-Spektrenanalyse&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

magnetic resonance spectroscopy von live- drosophila melanogaster verwendung von magic angle spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HR-MAS-) Protonen-Magnetresonanz-Spektroskopie (<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS) ist ein neuartiges zerstörungsfreies Verfahren, das spektrale Linienbreiten verbessert und ermöglicht hochauflösende Spektren von Extrakten, intakte Zellen, Zellkulturen, und vor allem intakte Gewebe gewonnen werden, um Beziehungen zwischen Metaboliten und zellulären Prozesse zu untersuchen.<em&gt; In-vivo-</em&gt; HR-MAS-<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS Studien stehen noch in der Live-Fruchtfliege gemeldet werden<em&gt; Drosophila melanogaster.</em&gt;<em&gt; Drosophila,</em&gt; Als einfachere genetische Organismus, ermöglicht die vielfältigen biologischen Funktionen und verschiedenen evolutionär konservierte Signalwege auf den gesamten Organismus-Ebene untersucht werden und es ist ein nützliches Modell für die Untersuchung von Genetik und Physiologie. Zu diesem Zweck entwickelten wir und umgesetzt<em&gt; In vivo</em&gt; HR-MAS-<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS-Methode zu untersuchen, zu leben<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit 14,1 T. Hier skizzieren wir ein HR-MAS-<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS-Protokoll für die molekulare Charakterisierung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit einem herkömmlichen MR-Spektrometer mit einer HR-MAS-Sonde ausgestattet. Diese Technik ist ein neuartiges,<em&gt; In vivo,</em&gt; Nicht-destruktiven<em&gt; Drosophila</em&gt; Metabolit Messung Ansatz, der die Identifizierung von krankheitsrelevanten Biomarkern ermöglicht und somit können neue therapeutische Entwicklung beitragen.

Diese Technik ermöglicht den Einsatz von hochauflösenden magic angle spinning Protonen MR-Spektroskopie (HR-MAS-1H-MRS) für die molekulare Charakterisierung von Live-<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Mit einem herkömmlichen 14,1-Tesla-Spektrometer mit einer HR-MAS-Sonde ausgestattet.

Magnetic Resonance Spectroscopy von Live- Drosophila melanogaster Verwendung von Magic Angle Spinning

Die hochauflösende Magic-Angle-Spinning-Protonen-Magnetresonanzspektroskopie (HRMAS 1H-MRS) ist eine neuartige, zerstörungsfreie Technik, welche die spektrale ...

24 Stunden vor dem Experiment wird eine männliche Fliege in ein zwei Milliliter fassendes Röhrchen gegeben. Nach kurzer Kühlung unter Eisnarkose wird die Fliege in den NMR-Rotor-Einsatz geschoben und anschließend in das Rotorröhrchen eingesetzt. Auf den Rotor-Einsatz wird eine Standardlösung mit TSP gegeben, danach werden die Rotoren mit einer Verschlusskappe verschlossen.Der Rotor wird in die H-R-M-A-S-Sonde eingeführt und am magischen Winkel von 54,7 Grad positioniert. Das Spektrometer wird zur Aufnahme eindimensionaler und zweidimensionaler Experimente eingestellt. Abschließend werden die Mr.Spectra der Proben analysiert.Ich bin Valeria Rigi aus dem NMR-Chirurgischen Labor der Abteilung für Chirurgie des Massachusetts General Hospital und der Harvard Medical School. Hallo, ich bin Y AB aus dem Labor für Molekulare Chirurgie der Abteilung für Chirurgie des Massachusetts General Hospital und der Harvard Medical School. Guten Tag, ich bin Lawrence Achman, Leiter des Labors für Molekulare Chirurgie und der Abteilung für Chirurgie am Massachusetts General Hospital und der Harvard Medical School.Und ich bin Mario Zika, Leiter des NMR-Chirurgischen Labors am Massachusetts Journal Hospital und assoziiert mit dem Aula Martin Center an der Harvard Medical School. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung großer Melanogaster mithilfe der medican-go-Spinning-Kernspinresonanzspektroskopie zeigen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um in vivo Sila-Metaboliten zu untersuchen, um Krankheitsbiomarker zu identifizieren, die zur Entwicklung neuartiger Therapien beitragen. Beginnen wir also.Bereiten Sie sich vor, indem Sie neu geschlüpfte Fliegen drei Tage lang sammeln und sie dann in Fläschchen mit frischem Fliegenfutter überführen. Inkubieren Sie die gesammelten Fliegen fünf Tage lang, sodass sie kurz vor dem Experiment fünf bis acht Tage alt sind. Für unsere Experimente verwenden wir ausschließlich männliche Fliegen.Bereiten Sie experimentelle 2-Milliliter-Röhrchen für die Fliegen vor, indem Sie mit einer mit der Flamme erhitzten Insulin-Spritze ein Loch in den Röhrchenverschluss bohren. Stellen Sie danach einzelne Fliegen in die Röhrchen, die ein Stück Fliegenfutter enthalten, und zwar 24 Stunden vor dem Experiment. Wiegen Sie die Röhrchen unmittelbar vor und nach dem Einfüllen der Fliege mit einer hochpräzisen Waage und ermitteln Sie das Gewicht jeder Fliege durch Subtraktion der beiden Werte.Eine einzelne männliche Fliege wiegt normalerweise etwa 0,7 bis ein Milligramm mit den vorbereiteten Fliegen. Schauen wir uns die Vorbereitung des Rotors für die hochauflösende Magic-Angle-Spinning oder H-R-M-A-S an. Zunächst.Stellen Sie ein einzelnes Röhrchen für weniger als eine Minute auf Eis. Um die Fliege darin zu betäuben, legen Sie die Fliege auf eine Schicht Aluminiumfolie, die auf Eis liegt, und schieben Sie sie vorsichtig mit einem weichen Pinsel in den halbkugelförmigen Hohlraum des NMR-Einsatzes. Stellen Sie sicher, dass die Fliege vollständig eingeführt ist, und vermeiden Sie dabei Verletzungen.Platzieren Sie den Insert in das Rotorrohr aus Zirkoniumoxid, um die Fliegen zwischen dem Rotoreinsatz und dem Boden des Rotors zu positionieren. Schließen Sie nun den Insert mit einer Schraube und bedecken Sie ihn mit Paraform, um jeglichen Kontakt zwischen der Fliege und der TSP-Standardlösung zu verhindern, die als Referenz sowohl für die Resonanzchemische Verschiebung als auch für die Quantifizierung dient. Geben Sie acht Mikroliter TSB-Standardlösung auf den Rotoreinsatz, sichern Sie die Lösung und befestigen Sie die gesamte Rotorkonstruktion mit der oberen Kappe. Nachdem der Rotor aufgebaut ist, sehen wir uns nun an, wie man H-R-M-A-S-Daten aufnimmt.Führen Sie den Rotor in die H-R-M-A-S-Sonde ein und positionieren Sie ihn am magischen Winkel von 54,7 Grad. Stellen Sie anschließend die H-R-M-A-S-H-Ein-MRS-Drehzahl auf zwei Kilohertz MAS ein und stabilisieren Sie diese mit einem MAS-Drehzahlregler. Stellen Sie die Temperatur mit einer BTO-2000-Einheit auf vier Grad Celsius ein.In Kombination mit der MAS-Pneumatikeinheit. Die Fliegen werden während ihres Aufenthalts im Spektrometer bei vier Grad Celsius gehalten, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, um den Magneten vorzubereiten, die Spule für eine optimale Leistung abzustimmen und den Magneten für eine optimale Spektralqualität zu shimmen. Sobald das Shimming abgeschlossen ist, synchronisieren Sie die INTERPULSE-Verzögerung mit der MAS-Rotationsfrequenz.Stellen Sie die Anzahl der Transienten auf 256 mit 32.768 Datenpunkten ein. Nehmen Sie ein eindimensionales Einzelflug-Spektrum unter Verwendung einer rotor synchronisierten car-, Purcell-MEO-Kill- oder CPMG-Spin-Echo-Pulssequenz auf. Diese Sequenz wirkt als T2-Filter, um spektrale Verbreiterung zu entfernen.Erwerben Sie nun zweidimensionale Einzel-Fliegen-Spektren aller Proben mithilfe einer Topsy-Sequenz mit ATIC-Pulsen. Öffnen Sie den Rotor und nehmen Sie die Fliege heraus. Sehen wir uns nun an, wie die Daten analysiert werden.Wir verwenden die Mare-Software zur Analyse der MR-Spektren unserer Proben. Verwenden Sie zunächst eine Linienverbreiterungsfunktion von 0,5 Hertz und wenden Sie diese auf alle HRM A SH one fis vor der Fourier-Transformation an. Beziehen Sie die MR-Spektren bezüglich TSP bei Delta gleich 0,0 Teilen pro Million ein.Phasieren Sie das Spektrum manuell und wenden Sie einen Whitaker-Baseline-Schätzer an, um die breiten Komponenten der Basislinie vor der Peakflächenberechnung zu subtrahieren. Schätzen Sie die Peakflächen mit der mastre-Software. Skalieren Sie die Peakhöhen bezüglich TSP für jedes aufgezeichnete Spektrum.Jetzt betrachten wir einige repräsentative MRS-Ergebnisse. Hier ist ein repräsentatives 1H-1H-COSY-Spektrum, das an Wildtyp-Fliegen der Oregon-R-Linie aufgezeichnet wurde. Hauptbestandteile der Lipide, Glycerin und kleine Metaboliten wie Beta-Alanin, Acetat, Phosphocholin und Phosphoethanolamin, wurden detektiert und gemäß früheren Berichten zugeordnet. Signale bei 2,02 ppm wurden den Methylengruppen-Protonen der Propangruppe von einfach ungesättigten Fettsäuren zugeordnet. Die ungesättigten Säuren wurden durch ein Signal bei 5,33 ppm identifiziert, das von den Protonen der Alken-Gruppe erzeugt wird.Kleine Metaboliten, die nicht zugeordnet werden konnten oder mit dem 1D-Spektrum nicht sichtbar waren, wurden mithilfe zweier DH-eins-H-eins-top-Z-H-R-M-A-S nachgewiesen. Soeben haben wir Ihnen erstmals gezeigt, wie man das biochemische Profil lebender Drosophila mittels hochauflösender Magic-Angle-Spinning-Kernresonanzspektroskopie untersucht. Bei dieser Methode ist es wichtig, ein weiches Plus zu verwenden, um die Fliegen einzusetzen, ohne sie zu verletzen.Stellen Sie sicher, dass Sie die Schraube nicht zu stark anziehen, um das Insekt nicht zu beschädigen, und nehmen Sie keine Spektren länger als eine Stunde auf, da die Fliegen andernfalls möglicherweise nicht überleben. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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