Name: Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Aktivierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut zur Bildung von Neutrophil Extracellular Traps (NETs). Diese Methode ermöglicht die Visualisierung durch Immunfluoreszenz- und Rasterelektronenmikroskopie.

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1. PMN Isolation aus menschlichem Blut Verwenden Sie ca. 24 ml menschliches Blut mit EDTA oder Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. <ol><li> Add 6 ml Histopaque 1119 bis ein 15 ml Falcon-Röhrchen und sorgfältig Schicht von 5 bis 7 ml Vollblut an der Spitze. </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse. </li><li> Absaugen und entsorgen gelblich und klar oberste Schicht und Transfer untere rötliche Phase mit Granulozyten in frischen Falcon-Röhrchen. </li><li> Wash-Zellen durch Auffüllen Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten eine 100% ige Percoll-Lösung durch Mischen 18 ml Percoll mit 2 ml 10x PBS. Mit 1x PBS vorzubereiten 4 ml Lösungen von 85%, 80%, 75%, 70% und 65% Percoll. </li><li> Bereiten Sie 2 Falcon Röhrchen mit einem Percoll-Gradienten durch die Schichtung von 2 ml jeder Prozentpunkt auf der jeweils anderen in absteigender Reihenfolge. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand, kombinieren Pellets und resuspendieren sedimentierten Zellen in 4 ml PBS. </li><li> Sorgfältig Layer 2 ml der Resuspension auf jede der Steigungen. </li><li> Zentrifuge für 20 Minuten bei 800 xg ohne Bremse. </li><li> Nach der Zentrifugation zu entfernen oberste Schicht und die meisten der 65%-Schicht mit PBMCs und sammeln weißen verbleibenden Interphase bis 85%-Schicht in neue Falcon-Röhrchen. </li><li> Wash-Zellen durch Auffüllen der Falcon-Röhrchen mit PBS und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> Entfernen Überstand und resuspendieren sedimentierten Zellen (in der Regel&gt; 95% sind PMN) in 2 ml PBS. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. </li></ol> 2. Aktivieren PMNs <ol><li> Bereiten Sie eine 24-well Zellkulturplatte, indem eine sterile 13 mm runden Deckglas (# 1,5) in jedes Well </li><li> Seed 2 x 10 5 Zellen in 500μl RPMI (mit 2% humanem Serum Albumin) pro Well und Inkubation für 1 Stunde in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten 600 nM PMA-Lösung in RPMI und fügen die Zellen 100 &amp;mgr; pro Vertiefung. Inkubieren von 15 min bis 4 h in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Fix-Zellen in 4% (Endkonzentration) Paraformaldehyd in PBS gelöst. </li></ol> PMA dient als positive Kontrolle und ist bis heute die stärkste Agent NET zu induzieren. Alternativ können auch andere Reize oder die Co-Kultivierung mit Krankheitserregern für NET Induktion verwendet werden. Der jeweilige Status der NET-Bildung kann überprüft während der Zeit natürlich verläuft, wenn zusätzliche parallele Proben vorbereitet werden. Wenn ein Nicht-Permeationsmittel DNA-Farbstoff wie Sytox Green (Invitrogen), die nicht fixierten Zellen aufgenommen wird, werden nur extrazelluläre DNA nachgewiesen werden. Seit der Gründung von neuen NETs ist irgendwie in der Gegenwart von Sytox beeinträchtigt, für jeden Zeitpunkt eine parallele Probe verwendet werden. 3. NET-Erkennung durch Immunomarkierung NETs sind sehr zerbrechlich, auch nach der Fixierung und müssen mit großer Vorsicht behandelt werden, sonst wird die Mehrheit bei der Vorbereitung zu verlieren. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Glasdeckgläschen mit anhaftenden Zellen aus 24-well Platte, indem Sie ihn bis an den Rand mit einer gebogenen Nadel und nutzen sie mit einer feinen Pinzette. Legen Sie das Deckglas umgekehrt auf einen Tropfen PBS. Dies kann auf einer Parafilm Blatt für ein Reagenzglas stand durchgeführt werden. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Inkubieren Deckgläser auf die gleiche Weise in einem Rückgang von 0,5% Triton X-100 für 1 min bei RT Zellen permeabilisieren zu. Wash 3 mal in PBS für 1 min. </li><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer mit Parafilm und einem feuchten Tuch. Legen Sie das Deckgläschen kopfüber auf einen Tropfen Blockierungspuffer (5% Esel-Serum) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Verdünnen Primärantikörper, zB ms anti Histon und rb anti Neutrophile Elastase, in Blocking-Puffer. </li><li> Transfer Deckgläser in der feuchten Kammer direkt aus Blockierungspuffer auf einen Rückgang des primären Antikörpers und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 3 x je 5 min mit PBS. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper, zB dk anti ms Cy2 und dk anti rb Cy3, in Blocking-Puffer. </li><li> Transfer Deckgläser in die feuchte Kammer auf einen Rückgang des sekundären Antikörper und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> 3 x je 5 min mit PBS. Abhängig von Ihrer Fluoreszenzmikroskopie Optionen Fleck DNA für 5 min entweder mit Hoechst 33342 (1 pg / ml), die UV-Anregung oder mit Draq5 für weit roten Anregung benötigen und waschen zweimal mit dest. Wasser. </li><li> Setzen Sie einen 20 &amp;mgr; l Tropfen Mowiol auf einen Objektträger und montieren Deckgläser mit Zellen auf den Kopf. Die Zellen müssen zwischen dem Deckglas und dem Objektträger werden. Die Tropfen Mowiol bilden eine dünne Schicht von homogenen Dicke, wenn das Deckglas auf den Tropfen positioniert ist. Normalerweise ist es nicht erforderlich, um die Probe zu drücken. Wenn Sie nicht Immersionslinsen verwenden möchten, wird die Probe zur Inspektion bereit.Für mikroskopische Analyse mit Immersionslinsen, lassen Sie die Probe trocken für etwa 1 Stunde, bis die Mowiol am Rand der Probe erstarrt ist. </li></ol> 4. Vorbereitung NETs für Rasterelektronenmikroskopie (SEM) <ol><li> Beitrag fix Zellen auf der Glasdeckgläschen in 24-Well-Platte mit 2,5% Glutaraldehyd. </li><li> Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 0,5% OsO4 und Inkubation für 30 min. </li><li> Entfernen Glasdeckgläschen enthält Zellen, die aus 24-well Platten und legte den Kopf auf einen Tropfen Wasser. Wash wie dieses 3-mal für 5 min. </li><li> Transfer Deckgläschen wieder in 24-well Zellkulturplatte mit 1% Gerbsäure und Inkubation für 30 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2 bis 4,4 </li><li> Entwässern durch die folgende Therapie (5min pro Stück): <ul><li> 30% Ethanol </li><li> 50% Ethanol </li><li> 70% Ethanol </li><li> 80% Ethanol </li><li> 90% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li><li> 100% Ethanol </li></ul></li><li> Transfer Deckgläser in kritischen Punkt Trockner und trockenen Proben. </li><li> Coat Oberfläche der Probe mit 5 nm Platin / Kohlenstoff-Schicht mit Dünnschichtverdampfer </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Isolierung Methode ergibt in der Regel nicht stimulierten lebensfähig Neutrophilen mit einer Reinheit von mehr als 95%. Wenn zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation fixiert, zeigt die Immunfärbung Protokoll die Reihenfolge der morphologischen Veränderungen während NETosis Zelle Abflachung, Verlust der nuklearen Läppchen, Verlust von Granulat und Kern Integrität, die eine zunehmende Überschneidung der Kernenergie (dh Histon) und körnig (dh führt Neutrophile Elastase) Färbung. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt, um die spezifischen Interaktionen von Pathogenen mit neutrophilen Granulozyten zu analysieren dienen. Diese Wechselwirkung kann in größerem Detail mit der Vorbereitung Protokoll für Scanning Electron Microscopy seziert werden. NET Fluorescence Beispiel der stimulierten Neutrophilen für NET-Komponenten (blau = DNA, rot = Histon, grün = Neutrophile Elastase) gefärbt. Die Bilder zeigen neben den NET-Lokalisierung, die nukleäre Lokalisation von DNA und Histonen und das körnige Muster für Neutrophile Elastase. SEM PMA-Stimulation Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zeigt nicht stimuliert und PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten. Nach Stimulation, glätten die Neutrophilen aus und produzieren NETs. SEM NETs und Shigella Höhere Auflösung REM-Aufnahme von Shigella Bakterien in NETs gefangen.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

Die zur Verfügung gestellten Protokoll ermöglicht die Trennung von nicht stimulierten Neutrophilen auf erhebliche Reinheit, die Induktion von NET Bildung und die Analyse der morphologischen Veränderungen während NETosis. Beim Umgang mit den Proben mit Sorgfalt, dh rauen Wasch-Bedingungen, die in den Verlust des größten Teils der lose NETs Ergebnis zu vermeiden, kann die Menge des NET-Bildung unter verschiedenen Bedingungen Stimulation (Dauer, Stimulus) verglichen werden. Neutrophilen / Pathogen-Interaktionen, Folge von Reizen, Zusammenspiel mit anderen Immunzellen: In dieser Hinsicht kann das mitgelieferte Protokolle als Ausgangspunkt, um Methoden zu etablieren, um anspruchsvollere Szenarien analysieren dienen.

neutrophil extracellular traps: so erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophile Granulozyten sind die häufigsten Gruppe von Leukozyten in das periphere Blut. Als professionelle Phagozyten, sie zu verschlingen Bakterien und töten sie intrazellulär, wenn ihre antimikrobielle Granula verschmelzen mit dem Phagosom. Wir fanden, dass Neutrophile eine zusätzliche Möglichkeit der Abtötung von Mikroorganismen haben: bei Aktivierung, geben sie Granulat Proteine ​​und Chromatin, die zusammen extrazelluläre Fasern binden Krankheitserreger. Diese neuartigen Strukturen oder Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degradieren Virulenzfaktoren und töten Bakterien 1, 2 und Pilze Parasiten 3. Die strukturelle Rückgrat der NETs ist die DNA, und sie sind schnell abgebaut in Gegenwart von DNasen. So sind Bakterien exprimiert DNasen virulenter 4. Mit korrelative Mikroskopie kombiniert TEM, SEM, Immunfluoreszenz und Live Cell Imaging Verfahren konnten wir zeigen, dass nach Stimulation, die Kerne der Neutrophilen ihre Form verlieren und die EU-und Heterochromatin zu homogenisieren. Später zerfallen die Kernhülle und das Granulat Membranen ermöglicht das Mischen von NET-Komponenten. Schließlich werden die NETs als die Zellmembran Pausen freigegeben. Das Zelltod-Programm (NETosis) unterscheidet sich von Apoptose und Nekrose und hängt von der Generation von reaktiven Sauerstoffspezies durch NADPH-Oxidase-5. Neutrophile extrazelluläre Fallen sind reichlich an den Standorten der akuten Entzündung. NETs scheint eine Form der angeborenen Immunantwort sein, dass zu binden Mikroorganismen, Verhütung ihrer Ausbreitung, und sorgen für eine hohe lokale Konzentration von antimikrobiellen Wirkstoffen zu Virulenzfaktoren erniedrigen und töten Krankheitserreger so dass Neutrophile auf ihre antimikrobielle Funktion auch über ihre Lebensdauer zu erfüllen. Es gibt zunehmend Hinweise, jedoch, dass die NETs auch in Krankheiten, die beteiligten reichen von Autoimmunsyndrome zu Unfruchtbarkeit 6. Wir beschreiben Methoden zur neutrophilen Granulozyten aus peripherem menschlichem Blut 7 zu isolieren und sie dazu anregen NETs zu bilden. Auch wir sind Protokolle, um die Netze in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophile Granulozyten sind die häufigste Gruppe von Leukozyten im peripheren Blut. Als professionelle Phagozyten umschließen sie Bakterien und töten diese ...

Neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs sind ein kürzlich entdeckter Mechanismus zur neutrophilen, pathogenen Abwehr, bei dem eine Kombination aus zytoplasmatischen und Granulaproteinen sowie Chromatin freigesetzt wird, wodurch neutrophile extrazelluläre Fasern entstehen, die Pathogene einfangen. In diesem Video werden Granulozyten aus menschlichem Vollblut mittels Histopaquedichtegradientenzentrifugation isoliert. Neutrophile werden aus der Granulozytenpräparation durch einen Percollgradienten gewonnen.Zentrifugation, auf Deckgläsern ausgesät und zur Netzbildung mit chemischen oder biologischen Stimuli stimuliert, werden die Zellen anschließend für die Immunfärbung oder die EM zur Visualisierung der NETs aufgearbeitet. Hallo, ich bin Christian Gosman von der Mikroskopie-Infrastruktur des Max-Planck-Instituts für Infektionsbiologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Reinigung von neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut und deren Stimulation zur Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen, auch NETs genannt.Anschließend visualisieren wir die Netze mittels Immunfluoreszenz und Rasterelektronenmikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Mechanismen, die zur Netzbildung führen, zu untersuchen und die antimikrobiellen Eigenschaften der Netze zu analysieren. Beginnen wir also.Beginnen Sie dieses Protokoll in einer Lamina-Flow-Haube, indem Sie sechs Milliliter Histo 1119 in jedes von vier bis fünfzehn Milliliter Falcon-Röhrchen pipettieren. Vorsichtig fünf bis sieben Milliliter Vollblut über das Histo in jedem Röhrchen schichten. Die Zentrifugenröhrchen 20 Minuten bei etwa 800 × g zentrifugieren, wobei sichergestellt werden muss, dass der Bremsvorgang nach Beendigung der Zentrifugation ausgeschaltet ist. Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.Das Röhrchen enthält vier deutlich voneinander getrennte Schichten von oben nach unten. Dies sind eine dunkelrote Schicht, die Erythrozyten enthält, eine hellrote Schicht, die die neutrophilen Granulozyten mit einigen Erythrozyten enthält, eine weißlich-gelbe Schicht, die Leukozyten und Serum enthält, und eine klare gelbe Schicht aus Serum.Erneut im laminarer Luftstrom-Arbeitsplatz arbeiten. Mit Hilfe der an ein Vakuumsystem angeschlossenen Perpette vorsichtig die obere gelbe Schicht abpipettieren. Anschließend mit einer Pipette die rotbraune Phase, die Granulozyten enthält, aus jedem Röhrchen in ein neues Falcon-Röhrchen überführen.Füllen Sie als Nächstes die Röhrchen mit PBS, um die Granulozyten zu waschen. Anschließend pelletieren Sie diese durch Zentrifugation 10 Minuten lang bei etwa 300 × g, während die Zellen rotieren. Bereiten Sie eine 100 %ige Per-Coll-Lösung vor, indem Sie 18 Milliliter Per-Coll mit zwei Millilitern 10× PBS mischen.Verwenden Sie dann die 100 %ige Per-Coll-Lösung und einmal PBS, um jeweils vier Milliliter der folgenden Konzentrationen herzustellen: 65, 70, 75, 80 und 85 % Per Coll. Verwenden Sie diese Lösungen, um Per-Coll-Gradienten herzustellen, indem Sie vorsichtig zwei Milliliter jeder Lösung in jeweils zwei Röhrchen schichten. Beginnen Sie damit, zwei Milliliter der 85 %igen Lösung in jedes Röhrchen zu pipettieren.Danach vorsichtig zwei Milliliter der 80 %igen Lösung auf die 85 %ige Lösung aufschichten. Fortsetzen, indem jeweils zwei Milliliter jeder Lösung in absteigender Reihenfolge aufgeschichtet werden, sodass die 65 %ige Lösung oben liegt. Entfernen Sie die sedimentierten Leukozyten unter dem Abzug aus der Zentrifuge.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS. Anschließend vereinigen Sie die resuspendierten Zellen in einem frischen Röhrchen. Schichten Sie vorsichtig zwei Milliliter der resuspendierten Granulozyten auf jede der Percoll-Gradienten auf.Anschließend 20 Minuten bei etwa 800 × g zentrifugieren und sicherstellen, dass der Bremsvorgang nach der Zentrifugation ausgeschaltet ist. Die Phasengrenzen sollten aufgrund der hohen Zelldichte deutlich sichtbar sein. Die oberste Schicht und den größten Teil der 65 %-Schicht, die periphere mononukleäre Blutzellen oder pBMCs enthalten, verwerfen.Sammeln Sie die 65–70%-Grenzfläche zusammen mit der 70–75%- und 80–85%-Grenzfläche von jedem Gradienten und überführen Sie sie in neue, frische Falcon-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen mit PBS auffüllen, und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei etwa 300 × g, um die Zellen nach der Zentrifugation zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die sedimentierten polymorphen kernhaltigen Leukozyten oder PMNs in zwei Milliliter PBS.An diesem Punkt werden 95 % oder mehr der Zellen in der Präparation mns sein. Mit einem Hämozytometer die Zellanzahl bestimmen, dann 200.000 Zellen in 500 Mikroliter RPMI auf sterile runde Deckgläser geben, die in Kulturplatten mit 15-Millimeter-Gruben platziert wurden. Eine Stunde lang in einem CO2-Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubieren, damit die Zellen nach einer Stunde an den Deckgläsern anhaften können.Fügen Sie 100 Mikroliter RPMI, das den gewünschten Stimulus enthält, hinzu. Führen Sie bei einem Zeitverlaufsversuch die Zugabe des Stimulus sequenziell durch, beginnend mit der längsten Stimulationszeit für jeden bedingten Zeitpunkt. Stellen Sie sicher, dass Sie eine positive Kontrolle vorbereiten, indem Sie 600 Nanomolar PMA in RPMI hinzufügen.Außerdem bereiten Sie für jede Bedingung oder jeden Zeitpunkt eine negative Kontrolle vor, indem Sie allein RPMI hinzufügen und bis zu vier Stunden in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der Stimulation kann die Bildung von NETs mittels Hellfeldmikroskopie überwacht werden. Kurz nach der Stimulation veränderten die Kerne ihre Form dramatisch. Sie verlieren ihre LOEs, runden sich auf und dehnen sich dann zum gewünschten Zeitpunkt mit 600 Mikrolitern Raumtemperatur-8%-Paraformaldehydlösung in jedes Well aus.Um die Endkonzentration auf 4 % einzustellen, für zwei bis vier Stunden zur Immunmarkierung inkubieren. Legen Sie ein Paraform-Blatt auf einen Reagenzglasständer mit dreimal acht Bohrungen von etwa 15 Millimeter Durchmesser. Um Vertiefungen zu bilden, füllen Sie die Vertiefungen mit PBS. Verwenden Sie eine gebogene Nadel, um jede der Deckgläser von dem Paraldehyd auf der Kulturplatte anzuheben. Greifen Sie dann mit einer Pinzette das Deckglas und kehren es auf die Oberfläche eines Tropfens PBS auf dem Paraform um. Zu diesem Zeitpunkt sind neutrophile extrazelluläre Fallen sehr empfindlich, und es ist größte Vorsicht während der Handhabung geboten, um Zellverlust zu vermeiden.Nach fünf Minuten den Waschschritt wiederholen, indem die Deckgläser in neue Tropfen von PBS überführt werden. Insgesamt dreimal waschen. Danach die Deckgläser zum Permeabilisieren der Zellen für eine Minute in einen Tropfen von 0,5 % Triton X-100 bei Raumtemperatur überführen.Danach nach der Wäsche dreimal für jeweils eine Minute in PBS waschen. Fahren Sie mit der Färbung gemäß der beigefügten schriftlichen Anleitung fort. Führen Sie jede der Inkubations- und Waschungen durch, indem Sie das Deckglas auf dem Paraform invertieren.Nachdem die Zellen angefärbt wurden, geben Sie einen 20-Mikroliter-Tropfen MO auf einen Objektträger und bringen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf, sodass die Zellen zwischen Deckglas und Objektträger liegen. Nach einer Stunde sollte das MOY erstarrt sein und die Zellen sind bereit für die mikroskopische Analyse. Unter Verwendung von Immersionslinsen bereiten Sie die Zellen zur Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie in einer chemischen Abzugshaube vor.Fixieren Sie die Zellen auf den Glasdeckgläsern in einer 24-Loch-Platte mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS für 30 Minuten. Während der Inkubation legen Sie ein Paraform-Blatt auf ein Reagenzglas. Stellen Sie es mit drei mal acht Bohrungen von etwa 15 Millimeter Durchmesser auf. Um Vertiefungen zu bilden. Füllen Sie die Vertiefungen mit destilliertem Wasser. Heben Sie jede Deckglasabdeckung mit einer gebogenen Nadel aus der Glutaraldehydlösung an.Danach mit einer Pinzette die Deckglasobjekte greifen und auf einen Tropfen destilliertes Wasser auf Paraform übertragen, indem die Deckgläser auf Tropfen destillierten Wassers auf Paraform gebracht werden. Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal, jeweils fünf Minuten lang. Danach übertragen Sie die Deckgläser zurück in die Vertiefungen der Zellkulturplatte, die 0,5 % Osmiumtetroxid in destilliertem Wasser enthalten, und inkubieren sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Deckgläser aus der Platte und waschen Sie sie dreimal wie zuvor mit destilliertem Wasser.Danach zurück in die 24-Well-Platte geben, wobei jedes Well 0,5 Milliliter 1 % Tanninsäure enthält, und 30 Minuten inkubieren. Anschließend die Deckgläser dreimal je fünf Minuten waschen. Danach die Fixierung mit Osmiumtetroxid und die Wäsche erneut durchführen.Danach das Reagenzglas abdecken. Mit einem neuen Stück Parafilm verschließen. Die Zellen durch eine Reihe von Inkubationen in den folgenden Ethanol-Lösungen jeweils fünf Minuten lang dehydrieren: 30, 50, 70, 80, 9100, 100.Und schließlich noch einmal in 100 % Ethanol. Tauchen Sie das Gestell in ein mit Ethanol gefülltes Präparatenschiffchen. Geben Sie die Deckgläser schnell in das Metallgestell, wobei darauf zu achten ist, dass die Präparate nicht austrocknen.Überführen Sie dann das Probenschiffchen in einen gekühlten Kritischen-Punkt-Trockner (CPD). Füllen Sie die Kammer des CPD mit flüssigem CO2. Lassen Sie das Einlassventil vollständig geöffnet, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten, und öffnen Sie, sobald sich am Boden der Kammer unterhalb der CO2-Schicht eine Phase von Ethanol zeigt, das Ablaufventil am Boden.Um den größten Teil des Ethanol zu entfernen. Lassen Sie die Kammer etwa 30 Minuten lang spülen. Schließen Sie nach dem Spülen das Einlassventil und senken Sie den Flüssigkeitsspiegel auf knapp unterhalb der Oberkante des Bootes ab.Leiten Sie heißes Wasser durch die Jacke des CPD. Wenn die Temperatur 36 bis 38 Grad Celsius erreicht und der Druck auf 1.200 Pfund pro Quadratzoll ansteigt, verschwindet die Grenzlinie zwischen Flüssigkeit und Gas, und die Proben befinden sich oberhalb des kritischen Punkts. Sobald der kritische Punkt erreicht ist, lassen Sie das Gas langsam über einen Zeitraum von fünf Minuten ab. Um Kondensation zu vermeiden, sollte die Temperatur bei etwa 40 Grad Celsius liegen. Öffnen Sie währenddessen die Tür und entfernen Sie das Boot. Stellen Sie sicher, dass das Dehydrierungslösungsmittel verdampft ist.Bringen Sie die Deckgläser mit der richtigen Seite nach oben auf den Klebstoff des Aluminiumprobenträgers an und überführen Sie sie in das Hochauflösungs-Beschichtungssystem. Evakuieren Sie den Beschichtungszylinder auf zwei mal 10 hoch minus fünf Millibar. Stellen Sie dann das Gerät auf 1,8 Kilovolt und 70 Milliampere ein und überwachen Sie die Dicke der Platinkohleschicht mit einem Quarz-Kristall-Dickenmessgerät, bis die Schicht fünf Nanometer erreicht hat.Entlüften Sie den Beschichtungszylinder des hochauflösenden Beschichtungssystems. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette die Proben vom Coter. Bringen Sie die Kammer des REM auf Normaldruck.Öffnen Sie die Tür. Danach setzen Sie die Proben in den Probenträger ein und evakuieren die Kammer. Für die REM-Analyse.Wenn sie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation fixiert werden, können morphologische Veränderungen während der NETose mittels Immunfluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. In dieser Abbildung ist die DNA als blauer Histon dargestellt. Der DNA-Komplex ist rot dargestellt und Neutrophilen-Elastase.Ein Granulamarker ist grün während der ersten Phase der NETose sichtbar, wobei zunächst nur der nukleäre Rand in kondensierten Kernen angefärbt ist. Später, wenn das Chromatin stärker dekondensiert ist, färbt sich der Großteil des Kerns in den dekondensierten NETs homogen an.Dieses Bildfeld zeigt die Überlagerung von kern- und granulärer Färbung, die bei der NETose auftritt. Dieses Rasterelektronenmikroskopbild zeigt nicht stimulierte Neutrophile nach Stimulation mit Ella-Bakterium; die Neutrophilen breiten sich aus und bilden neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs). Hier wurde ein Gel-Bakterium in den Fallen eingefangen.Bakterien wie Gel werden durch die in den Netzen vorhandenen Enzyme immobilisiert und abgetötet. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Neutrophile Granulozyten aus menschlichem Blut isoliert und stimuliert, um die Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen zu induzieren. Diese können anschließend mittels Immunfluoreszenz oder Rasterelektronenmikroskopie weiter analysiert werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Netze auch nach der Fixierung sehr empfindlich sind. Um den Verlust der Netze zu minimieren, entnehmen wir die Deckgläser mit den stimulierten Neutrophilen aus den Vertiefungen und führen den größten Teil des Verfahrens auf der Oberfläche von Puffertröpfchen durch. Dennoch ist es wichtig, die Proben vorsichtig und langsam zu bewegen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Fluoreszenzfärbung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), den extrazellulären DNA-Komponenten, die von Neutrophilen ausgestoßen werden. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der adhäsiven Interaktion zwischen Krebszellen und NETs.

Fluoreszenzmikroskopie von neutrophilen extrazellulären Fallen oder NETs: Eine Technik zur Beobachtung der adhäsiven Interaktion zwischen Krebszellen und NETs

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Erzeugung und Isolierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Neutrophile werden aus peripherem Blut isoliert und mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert, um NETs zu produzieren. Während der Inkubation durchlaufen die Neutrophilen einen Prozess des Zelltods (NETose), um NETs freizusetzen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen, das mit granulären zytoplasmatischen Proteinen gemischt ist.

Eine In-vitro-Technik zur Erzeugung von extrazellulären Fallen für humane Neutrophile

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Lernen Sie die Isolation und Aktivierung von Neutrophilen aus menschlichem Blut zur Bildung von Neutrophil Extracellular Traps (NETs). Diese Methode ermöglicht die Visualisierung durch Immunfluoreszenz- und Rasterelektronenmikroskopie.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

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