Name: Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Visualisierung von DNA-Reparaturkomplexen in Bacillus subtilis mittels GFP-Fusionsproteinen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reaktionen auf DNA-Schäden und genomische Stabilität.

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Die Autoren möchten Drs danken. Philine S. Lee und Alan D. Grossman für zunächst Ausbildung LAS in der Fluoreszenzmikroskopie. Die Autoren danken Drs. Melanie Berkmen und Hajime Kobayashi um Hilfe und Tipps für die Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem College of Literature, Science &amp; Arts und vom Department of Molecular, Cellular, und Entwicklungsbiologie an der University of Michigan unterstützt.

Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie 1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden. <ol class="ualpha"><li> Für einige B. subtilis-Stämme (insbesondere Stämme, die schlecht wachsen, durch die Integration der translationale Fusion zwischen dem Gen von Interesse und GFP in seiner endogenen Locus), anfängliche Wachstum für zwei Tage vor der Bildgebung ist notwendig für qualitativ hochwertige Bilder. Am ersten Tag, Streifen der B. subtilis-Stamm, auf LB-Agar mit selektiven Antibiotikum (s) abgebildet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am zweiten Tag, impfen 100 ul von 0,85% Kochsalzlösung mit einer einzelnen Kolonie, und führen Sie drei 10-fache serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten (mit selektiven Antibiotika), Plattieren 100 ul jeder Verdünnung durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C. Am dritten Tag, wählen Sie die Verdünnung Platte mit Licht konfluenten Wachstum der Zellen. Licht konfluenten Wachstum auf einer Platte wird das Nährmedium mit einer gesunden, exponentiell wachsenden Starter Inokulum potenziell ergeben exzellente Bildergebnisse (siehe Schritt 4) liefern. Dieser Schritt ist besonders nützlich für die höchste Qualität Membran-Bildgebung mit der Fleck FM4-64. </li><li> Andere B. subtilis-Stämmen kann einfach auf selektive LB-Agar-Medium für einzelne Kolonien mit einer sterilen Stick am Tag vor der Bildgebung angewendet werden beimpft und über Nacht bei 30 ° C. Am folgenden Tag werden die Zellen auf dieser Platte ausreichend sein, um als Inokulum für die Bildgebung zu verwenden (siehe Schritt 4). HINWEIS: B. subtilis, werden über Nacht Kulturen in flüssigem Medium nicht angemessen auf eine Kombination der Sporenbildung und die Beschlussfähigkeit Antworten, die über einen längeren Zeitraum Lag-Phase Wachstum 1 führen wird. </li></ol> 2. Am Morgen des Imaging, 10 ml S7 50 3.1 Medium in einem 125 ml sterilen Erlenmeyerkolben. 3. Resuspendieren der Zellen in bis zu 2 mL der S7 50 mittelgroßen aus dem LB-Agar-Platte mit einzelnen Kolonien oder das Licht konfluenten Zellen zu einem Inokulum erhalten. 4. Fügen Sie genug S7 50 mittelgroßen Zelle Inokulum auf die Erlenmeyerkolben mit 10 mL S7 50 mittelgroßen für eine Kultur mit einer anfänglichen optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD 600) von ~ 0,08 bis 0,1. Bei diesem Schritt ist es wichtig, mindestens eine 10-fache Luft bis mittlere Verhältnis haben. So verwenden wir 10 bis 12,5 ml beimpft Medium in einem 125 mL Erlenmeyerkolben. 5. Wachsen jeder Kultur bei 30 ° C bis die Kultur eine OD 600 erreicht ~ 0,5-0,8. Schüttelwasserbäder mit Umdrehungen pro Minute 150 bis 200 bevorzugt. Kulturen mit DNA-schädigenden oder mismatch induzierende Mittel herausgefordert sollten in einem frühen exponentiellen Wachstumsphase werden OD 600, so dass die Zellen das Ziel zu erreichen OD 600 mit der zusätzlichen Zeit des Wachstums, die für die Behandlung erforderlich ist (siehe Tabelle 1) Zum Beispiel erfordert 2-Amino einer Stunde Behandlung und damit eine Kultur mit 2-Amino behandelt werden, sollten bei OD 600 ~ 0,3-0,4 werden, so dass die eine Stunde Behandlung / Wachstum führt zu einer OD 600 ~ 0,5-0,8, wobei Zellen sind bereit für die Bildgebung. Probenvorbereitung 1. Pipette 300 pl kultivierten Zellen in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. 2. Wenn Bildgebung von Zell-Membranen gewünscht wird, fügen 1:1000 Verdünnung von FM4-64 Membran-Färbung (Invitrogen) zu jeder Probe aus einer 1 mg / ml Stammlösung. Eine Titration von FM4-64 erforderlich, um die gewünschte Fluoreszenz-Signal zu erzielen. Ein typisches Titration Bereich liegt bei 1:100, 1:1000 und 1:10.000. 3. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur für bis zu 10 Minuten oder zu sitzen, während die Folie wird mit 1% Agarose in 1X Spizizens Medium hergestellt, wie unten beschrieben (siehe Schritt 1 unter "Präparat"). 4. Wenn die Konzentration der Zellen erforderlich ist, bevorzugen wir Filterung Zellen unter Verwendung eines 0,2 um-Filter mit einer Vakuumapparatur. Die Zellen können dann leicht von der Oberfläche des Filters mit PBS, eine andere geeignete Puffer oder Medium vor Visualisierung gewaschen werden. Slide Vorbereitung 1. Bereiten Sie 1% Agarose mit 1X Spizizens. 5 ml 10X Spizizens Lager bis 45 ml ddH2O zusammen mit 0,5 g Agarose und Mikrowelle zu schmelzen. Hot geschmolzene Agarose ist schwierig, Pipette, und erstarrte Agarose wird nicht in die Pipettenspitze. Die Agarose sollte in einem Wasserbad äquilibriert auf eine Temperatur von ~ 55-65 ° C für sie die Pipettenspitze geben, ohne Verfestigung in der tip. 2. Draw 20 ul Spizizens mit 1% geschmolzener Agarose in die Pipettenspitze. Pipette einen Tropfen (etwa 1-2 ul) der Agarose-Lösung in jede Folie gut (wir benutzen 15-gut gleitet, siehe Tabelle 2) zu seicht Agarose Pads bilden. Die Agarose wird sofort erstarren. Folien müssen auch unmittelbar vor der Applikation der Zellen sein. Wenn die Agarose Pads bei Raumtemperatur allein gelassen werden, können sie innerhalb weniger Minuten austrocknen und unbrauchbar werden. Agarose-Pads sollten zentriert und füllen jedes Loch aber minimale Höhe zu verhindern, dass das Deckglas, wenn Tröpfchen sind zu hoch (bubble-like) oder wenn die Probe breitet sich über die gut Grenze, einfach streichen die auch sauber und mit einer Kimwipe und anwenden neue Agarose-Pad. 3. Übernehmen Sie die gesamte 300 ul Probe (siehe Schritt 6), um die Folie, auf der Oberseite jeder Agarose Pad verteilt. Diese Menge an Zellen sollte ausreichen, um jedes Loch auf der Folie abdecken. 4. Lassen Sie die Folie mit Zellen geladen werden, um bei Raumtemperatur stehen lassen (23 ° C) für etwa 10 Minuten. Dieser Schritt wird für die Zellen auf dem Agarose-Pad zu unbeweglich und bereit für die Bildgebung niederlassen können. Für spezielle Bedürfnisse dieser Temperatur müssen möglicherweise geändert werden, zum Beispiel werden bei der Durchführung von Experimenten, die einen Temperatur-Shift 4 erfordern. 5. Absaugen entfernt das überschüssige Medium aus jeder Vertiefung, ohne die Pads selber. 6. Wenden Sie das Deckglas auf die Folie, Pressen fest und gleichmäßig, aber vorsichtig, über den Bereich der Folie. Vergewissern Sie sich, dass das Deckglas vor dem Schlitten und dass das Deckglas ist nicht über die Folie angehoben wird. Visualisierung von Zellen 1. Viele verschiedene Fluoreszenz-Mikroskopen wird gut funktionieren. Es ist wichtig, zu einem 100X Ölimmersion haben. Die Simmons Lab verwendet: <ul><li> Olympus BX61 Mikroskop mit 1,45 NA TIRFM 100X Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD gekühlte Kamera </li><li> Lumen 200 Bogen Metall (Vor-) Lichtquelle. </li><li> Für die Detektion von GFP (FITC), Filter Anregung 460-500 und 510-560 Emission </li><li> Für den Nachweis von FM4-64 (TRITC), Filter Anregung 510-560 und 572-648 Emission. </li><li> Die Bilder wurden aufgenommen mit SlideBook 4,2 (Abbildung 1) </li></ul> 2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus mit weißem Licht. 3. Nehmen Sie das Bild mit Hilfe geeigneter Filter für jedes Fluorophor. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Bilder angezeigt werden (Abbildung 1). GFP Brennpunkte sollte gut definiert, während FM4-64-Färbung sollte hell und klar, 4-7. GFP oder Membran Bilder können pseudo-farbig mit einer beliebigen Farbe, um die höchste Bildqualität, ohne dass Daten verloren gehen vorgestellt werden können. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Repräsentative GFP Bilder von B. subtilis translationale Fusionsproteine. GFP-Proteine ​​sind in grün dargestellt, während FM4-64 Membranfärbung in rot dargestellt wird. Der weiße Maßstab zeigt 3 mu m (A) MutS-GFP [relevant Genotyp: mutS - gfp (SPC), amyE: Pspac mutL (cat)]. In Gegenwart von 600 ug / mL 2-Amino-und 1 mM IPTG. FM4-64-Signal wird nicht dargestellt, um deutlicher zu zeigen, die MutS-GFP Brennpunkte (B) MutL-GFP [relevant Genotyp: mutL: mutL-GFP (SPC)].. In Gegenwart von 2-Amino (C) DnaX-GFP [relevant Genotyp: DnaX: DnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevant Genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] in Gegenwart von 20 ng / mL Mitomycin C (E) tagC-GFP [relevant Genotyp: tagC: tagC-GFP (SPC) ] in Gegenwart von 1 pg / mL Mitomycin C. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Treatment / Konzentration oder Menge </td><td> Funktion </td><td> Die Zeit der Inkubation </td></tr><tr><td> Mitomycin C (MMC) [20 bis 150 ng / mL] </td><td> DNA Alkylierungsmittel </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> 2-Amino (2-AP) [600 ug / mL] </td><td> Missverhältnis zu induzieren </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> Hydroxyurea (HU) </td><td> erschöpft dNTPs </td><td> 3 Stunden </td></tr><tr><td> ultraviolettem Licht (UV) 20 J/m2 </td><td> Thymin-Thymin-Dimeren und 6-4 Photoprodukte </td><td> variiert je nach Quelle, in der Regel 20 Sekunden </td></tr><tr><td> Grau (ionisierende Strahlung) von 5 bis 100 Gy </td><td> Doppelstrangbrüche, Einzel-Strangbrüchen und Grundschaden Websites </td><td> variiert je nach Quelle </td></tr></tbody></table>"&gt; Tabelle 1. Zusammenfassung von DNA-schädigenden und Mismatch induzierenden Behandlungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Multitest Rutsche, 15-gut </td><td> MP Biomedicals </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12 bis 544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fischer </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, Handschuhe tragen </td></tr><tr><td> 2-Amino </td><td> Sigma </td><td> A3509-250MG </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> Hydroxyurea </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> Handschuhe </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> lichtempfindlich </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien und Geräte:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Grenze belasten...

Spezielle Lösung Rezepte 1: 10x S7 50 Salze 0,5 M MOPS 100 mM Ammoniumsulfat 50 mM Kaliumphosphat Einbasisches Filter sterilisieren, und wickeln S7 50 Medien in der Folie vor der Lagerung 100x Metals 0,2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0,1 mM ZnCl 2 100 ug / ml Thiamin HCl 2 mM HCl 0,5 mM FeCl 3 * dH 2 O auf Endvolumen * FeCl 3 dauern sollte hinzugefügt werden, um Niederschlag zu verhindern. Nach Sterilfiltration, wickeln 100x Metall-Lösung in Folie. S7 50 Medien 1x S7 50 Salze 1x Metall 1% Glucose 0,1% Glutamat 40 ug / mL Tryptophan 40 ug / mL Phenylalanin destilliertem H 2 O auf Endvolumen 10x Spizizens (g / L) 151,4 mM Ammoniumsulfat (20 g / L) 803,8 mM Kaliumphosphat Einbasisches (140g / L) 440,9 mM Kaliumphosphat dibasisch (60g / L) 34,0 mm Natriumcitrat (10g / L) 16,6 mM MgSO 4 (2g / l) dH 2 O auf Endvolumen Filter sterilisieren

imaging mismatch reparatur und zellulären reaktionen auf dna-schäden in bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine ​​und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine ​​an ihre spezifischen Läsionen<em&gt; In vivo</em&gt; Und zu verstehen, wie diese Proteine ​​in bakteriellen Zellen organisiert sind. Darüber hinaus haben der Transkription und Translation Fusionen im Zusammenhang mit DNA-Schäden Promotoren zeigten die Zellen innerhalb einer Population haben genotoxischen Stress-Reaktionen aktiviert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie zur Abbildung der Montage der DNA-Reparatur und DNA-Replikation Komplexe in einzelnen Bakterienzellen. Insbesondere konzentriert sich diese Arbeit auf die Bildgebung Mismatch-Reparatur-Proteine, die homologe Rekombination, DNA-Replikation und eine SOS-induzierbare Protein in<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Alle hier beschriebenen Verfahren leicht zugänglich sind für die Bildgebung Protein-Komplexe in einer Vielzahl von Bakterienarten.

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Zellen.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten reagieren auf DNA-Schäden mit einer komplexen Reihe physiologischer Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung ...

Erzeugen Sie TLU-Stämme mit translationalen Fusionskonstrukten der Fehlpaarungsreparatur. Auf selektivem Medium aufgetragene Proteine, die mit GFP fusioniert sind, werden ausgestrichen. Die ausgestrichenen Zellen werden für eine frische Inokulation in Flüssigkultur verwendet.Die Zellen werden bis zu einem OD 600 von 0,3 bis 0,4 kultiviert, woraufhin die gewünschten Behandlungen zur Induktion von Fehlpaarungen angewendet werden, und die Zellen weiter kultiviert, bis ein OD 600 von 0,5 bis 0,8 erreicht ist; anschließend werden die Zellen entnommen. Der Membranfarbstoff FM 4 64 wird gegebenenfalls hinzugefügt, und die Zellen werden auf Objektträger mit vorbereiteten Agarose-Pads aufgebracht und nach Entfernung des überschüssigen Mediums zum Sedimentieren gebracht. Durch Absaugen.Ein Deckglas wird aufgelegt und die Zellen werden mittels Mikroskopie sichtbar gemacht. Hallo, ich bin Dr. Andrew Kow aus dem Labor von Dr. Lyle Simmons am Department für Molekulare, Zelluläre und Entwicklungsbiologie der University of Michigan in Ann Arbor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem translationsgekoppelte Fusionen von DNA-Mismatch-Reparaturproteinen sowie weiterer Reparatur- und ribosomaler Proteine in Bacillus solus sichtbar gemacht werden können.Wir verwenden dieses Verfahren, um die Interaktion zwischen den DNA-Mismatch-Reparaturproteinen und den ribosomalen Proteinen in lebenden Zellen von Bacillus subtilis zu untersuchen. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, bereiten Sie die B-sublist-Stämme vor, die das translatio­nale Fusionsprotein enthalten, das Sie für bestimmte Stämme sichtbar machen möchten.Der Beginn einen Tag vor der Bildgebung ist ausreichend. Beispiele hierfür sind Stämme, die gut wachsen, wenn die translatationale Fusion zwischen GFP und dem Gen der Interesse an die endogene Lokus des Gens eingefügt wird, wie zum Beispiel MU LGFP. Wenn der Beginn einen Tag vor der Bildgebung erfolgt, verwenden Sie unter sterilen Bedingungen einen sterilen Abstrichstab, um die Bakterien auf selektivem LB-Agar-Medium in Petrischalen aufzutragen.Um Einzelkolonien zu erhalten, über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren; am nächsten Tag werden die Kolonien als Animpfstoff verwendet. Einige B.-sublist-Stämme benötigen zwei Wachstumstage vor der Mikroskopie, um hochwertige Bilder zu erhalten. Zu den spezifischen Stämmen, die ein zweitägiges Wachstum erfordern, gehören solche mit schlechtem Wachstum aufgrund der translationalen Fusion, wie beispielsweise recA-GFP. Am ersten Tag die Bakterien auf selektivem LB-AED ausstreichen und über Nacht inkubieren.Am zweiten Tag eine serielle Verdünnung durchführen. Zunächst eine einzelne Kolonie auswählen, um 100 Mikroliter 0,85 %iger Salzlösung zu beimpfen, dann viermal eine zehnfache serielle Verdünnung vornehmen und jeweils 100 Mikroliter jeder Salzlösungsverdünnung sowie der Ausgangskolonie und der Salzlösung auf LB-Agar-Platten mit selektiven Antibiotika ausplattieren. Die Platten über Nacht inkubieren, üblicherweise bei 30 °C, nach der zweiten Übernacht-Inkubation. Die Verdünnungsplatte auswählen, die ein leicht konfluentes Zellwachstum aufweist.Diese liefern eine gesunde, exponentiell wachsende Startinokulation, die möglicherweise hervorragende Bildgebungsresultate ergibt. Dies ist besonders nützlich für die qualitativ hochwertigste Abbildung der Membranfärbung. Geben Sie am Morgen der Bildgebung FM 4 64 in 10 Milliliter S sieben 50 Medium in eine 125 Milliliter fassende sterile Flasche.Dadurch wird ein Luft-zu-Medium-Verhältnis von mindestens 10:1 aufrechterhalten. Resuspendieren Sie die Zellen in bis zu zwei Milliliter S750-Medium aus der LPPL mit einzelnen Kolonien oder ähnlich konfluenten Zellen, um einen Inokulum zu erhalten. Geben Sie ausreichend S750-Medium mit Zellinokulum zu dem Erlenmeyerkolben, der 10 Milliliter S750-Medium enthält, sodass die Kultur einen initialen OD600 von etwa 0,08 bis 0,1 aufweist.Als Nächstes jede Kultur bei der geeigneten Temperatur für die B-Unterliste-Zelle wachsen lassen, die abgebildet werden soll. Bevorzugt sind schüttelnde Wasserbäder mit 150 bis 200 Umdrehungen pro Minute. Die Kulturen weiterwachsen lassen, bis sie eine OD 600 von etwa 0,5 bis 0,8 erreichen.Für Kulturen, die mit DNA-schädigenden oder Fehlpaarungen induzierenden Substanzen behandelt werden, sollte die Behandlung so geplant werden, dass das Ende der Inkubationszeit mit dem DNA-verändernden Wirkstoff mit dem Erreichen der Ziel-OD 600 zusammenfällt. Beispielsweise erfordert Zwei-Aminopurin, ein DNA-Analogon, das eine falsch gepaarte Base imitiert, wenn es in das Genom eingebaut wird, eine einstündige Inkubation und führt zur Fokusbildung von Fehlpaarungsreparaturproteinen wie mutL-GFP. Die Fokusbildung von RecA-GFP hingegen erfordert eine einstündige Inkubation mit Mitomycin C oder einem anderen DNA-schädigenden Reagenz zur Induktion von Doppelstrangbrüchen; sowohl Zwei-Aminopurin als auch Mitomycin C werden hinzugefügt.Wenn die Kulturen einen OD 600 von etwa 0,3 bis 0,4 erreicht haben und nach der erforderlichen einstündigen Wachstumsphase mit der jeweiligen Behandlung, haben die Kulturen höchstwahrscheinlich einen OD 600 von 0,5 bis 0,8 erreicht und sind bereit für die Bildgebung. Beginnen Sie damit, 300 Mikroliter der kultivierten Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen abzupipettieren. Falls eine Bildgebung der zellulären Membranen bei einer Verdünnung von 1 zu 1000 eines FM 4 64-Membranfarbstoffs mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter für jede Probe gewünscht ist, kann eine Titration von FM 4 64 erforderlich sein, um das gewünschte Fluoreszenzsignal zu erzielen.Ein typischer Titrationsbereich liegt zwischen eins zu 100, eins zu 1000 und eins zu 10.000. Lassen Sie die Proben bis zu 10 Minuten stehen oder solange, bis die Objektträger vorbereitet sind. Falls die Zellkonzentration bestimmt werden muss, filtrieren Sie die Zellen mithilfe eines 0,2-Mikrometer-Filters mit einer Vakuumanlage.Waschen Sie die Zellen dann vorsichtig mit geeignetem Puffer oder Medium von dem Filter ab, während die Zellenproben mit FM 4-64 inkubieren. Bereiten Sie 1 % Agarose mit einem x Zens zu, indem Sie fünf Milliliter 10 x Zens-Standardlösung zu 45 Milliliter destilliertem Wasser sowie 0,5 Gramm Agarose hinzufügen und in der Mikrowelle zum Schmelzen bringen.Lassen Sie die Temperatur des Agarose in einem Wasserbad auf etwa 65 Grad Celsius einstellen und pipettieren Sie 20 Mikroliter der Probe. Geben Sie am Ende 1 % geschmolzene Agarose in eine Pipettenspitze. Zu heißes Agarose ist schwer zu pipettieren, und kalte Agarose verfestigt sich und tritt nicht in die Pipettenspitze ein.Als Nächstes verwenden Sie einen Multitest-Objektträger mit 15 Vertiefungen und pipettieren einen einzelnen Tropfen von etwa ein bis zwei Mikrolitern der Aros-Lösung in jede Vertiefung des Objektträgers, um flache Aros-Pads zu bilden; das Aros erstarrt sofort.Die Objektträger werden unmittelbar vor dem Aufbringen der Zellen vorbereitet, um eine Austrocknung zu vermeiden, die die Objektträger unbrauchbar machen würde. Die Aros-Pads sollten mittig positioniert sein und jedes Loch vollständig ausfüllen, jedoch minimale Höhe aufweisen, um die Deckgläser nicht zu stören. Falls die Tröpfchen zu hoch sind oder blasenartig erscheinen bzw. die Probe über die Lochgrenze hinausläuft, einfach das Loch mit einem Kim-Wipe sauber wischen und ein neues Aros-Pad auftragen.Nun, da der Objektträger vorbereitet ist, geben Sie die gesamten 300 Mikroliter der zuvor beiseitegestellten Probe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf den Objektträger, wobei die Probe auf der Oberseite jedes Aeros-Pads verteilt wird. Diese Zellmenge sollte ausreichen, um jede Vertiefung des Objektträgers zu bedecken. Lassen Sie den mit Zellen beladenen Objektträger etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Dieser Schritt ermöglicht es den Zellen, sich auf dem Agarose-Pad abzusetzen und unbeweglich zu werden, sodass sie am Ende der 10-minütigen Inkubation zur Bildgebung bereitstehen. Aspirieren Sie das überschüssige Medium aus jedem Well, ohne dabei die Pads selbst zu entfernen. Legen Sie den Deckglaser auf den Objektträger und drücken Sie fest und gleichmäßig, aber vorsichtig über die gesamte Fläche des Objektträgers; überprüfen Sie, ob der Deckglaser vollständig anliegt und nicht über den Objektträger hinausragt.Fahren Sie mit der Bildgebung fort – viele verschiedene Fluoreszenzmikroskope eignen sich gut dafür. Es ist entscheidend, ein 100x-Ölimmersionsobjektiv zu verwenden. Das Simmons-Labor nutzt ein Olympus-BX-61-Mikroskop, das mit einem 100x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,45 ausgestattet ist und für die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TIRF geeignet ist.Das Mikroskop ist außerdem mit einer CCD-Kamera mit Kühlung und einer LU-200-Arch-Metalllichtquelle ausgestattet. Bringen Sie zunächst die Zellen mit weißem Licht in den Fokus. Verwenden Sie für jede Flora den entsprechenden Filter.Vier zur Detektion von GFP. Verwenden Sie einen Anregungsfilter von 460 bis 500 und einen Emissionsfilter von 510 bis 560 zur Detektion von FM 4-64. Verwenden Sie einen Anregungsfilter von 510 bis 560 und einen Emissionsfilter von 572 bis 648.Nehmen Sie das Bild mit den geeigneten Filtern für jede Ebene auf. Vier mit der Slide-Book-4.2-Software. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Abbildung des DNA-Mismatch-Reparaturproteins MU L, das translationsmäßig mit GFP fusioniert wurde.Die unbehandelte Kontrollkultur von MU LGFP zeigt minimale Foci, wobei die meisten Zellen nur zytoplasmatische Mengen des mut-LGFP-Fusionsproteins enthalten. Im Gegensatz dazu weisen die meisten Zellen, die in Gegenwart von zwei Aminopurin gezüchtet wurden – das im Genom eingebaut eine falsch gepaarte Base mimt – GFP-Foci auf, was darauf hinweist, dass das mutale GFP-Protein an der Erkennung und Reparatur falsch gepaarter DNA-Basen beteiligt ist.Ähnliche Ergebnisse werden mit dem REC A GFP-Stamm erzielt, der in Gegenwart des DNA-schädigenden Wirkstoffs Mitomycin C kultiviert wurde. Hier enthalten die meisten Zellen nach Behandlung mit Mitomycin C einen Fokus von rec A GFP, was darauf hinweist, dass rec A GFP auf die DNA-Schädigung reagiert und den Reparaturprozess eingeleitet hat, im Gegensatz zu unbehandelten Zellen mit pho IR. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie Reparaturproteine in lebenden facius-subtilsten Zellen sichtbar gemacht werden können. Bei Durchführung dieses Verfahrens.Es ist wichtig, sich Zeit zu nehmen und die Zellen sorgfältig in den richtigen Fokus zu bringen, was möglicherweise etwas Übung erfordert. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

Erfahren Sie die Echtzeit-Visualisierung von DNA-Reparaturkomplexen in Bacillus subtilis mittels GFP-Fusionsproteinen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reaktionen auf DNA-Schäden und genomische Stabilität.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis

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