Name: Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Lernen Sie die In-ovo-Elektroporation zur Visualisierung axonaler Bahnen genetisch definierter Neuronen im embryonalen Hühner-Rückenmark. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zur neuronalen Entwicklung.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien an AK von der Israel Science Foundation, The Israel Ministerium für Gesundheit und DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) unterstützt.

I. Die Elektroporation Egg Handling <ol><li> Legen Sie die Eier in einem befeuchteten Inkubator eingestellt auf 37-38 ° C, vorzugsweise einem Inkubator mit einem Schaukelstuhl Tabletts. </li><li> Embryo nach etwa 66 Stunden der Inkubation elektroporiert, wenn sie Hamburger und Hamilton (HH) Stufe 18-20 erreicht haben. In diesem Stadium der Kopf liegt im rechten Winkel zum Rumpf (Bedingung genannt zervikalen Biegung) und eine große Reihe von extra-embryonalen Blutgefäße, wie anterior, posterior, rechts und links Dottervenen gesehen werden sollte. Dies ist eine optimale Bühne für Enhancer-abhängigen Expression 1,3,4. Es ist wichtig, Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators zu überwachen, um tragfähige und synchronisiert Embryonen zu erhalten. </li><li> Nach 66 Stunden Inkubation, entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator. Legen Sie die Eier horizontal. Warten Sie 5-10 Minuten. Der Embryo ist jetzt am oberen Pol des Eies befindet. </li></ol> Die Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Hank-Lösung mit Penicillin / Streptomycin (P / S) (1:100 Verdünnung). </li><li> Pull Glaskapillaren (0,5 mm Durchmesser) zu Mikrokapillare. </li><li> Platzieren Sie die Elektroden (Wolfram) in Mikromanipulator und verbinden Elektroden an den Impulsgenerator (ECM 830). </li><li> Passen Sie den Impulsgeber mit folgenden Parametern: Spannung 30V, Anzahl der Impulse - 3, Länge des Impulses 50 ms. </li><li> Bereiten Sie einen Mund pipettieren, eine Kanüle und ein Band. </li><li> Bereiten Sie eine beliebige Mischung von DNA (2-5μg/μl) und fügen Sie ein Fast Green Farbstoff. </li></ol> Windowing und Elektroporation <ol><li> Mit einer Spritze entfernen 5-6 ml von Albumin aus jedem Ei. </li><li> Mit einer kleinen Schere öffnen Sie eine ovale Fenster an der Oberseite des Eies. </li><li> Moist der Embryo mit 0,5-1ml Hanks + P / S-Lösung. </li><li> Verwenden Sie einen Mund pipettieren, laden Sie das Glas mit DNA-Gemisch Mikrokapillare. </li><li> Setzen Sie den Embryo mit seinem Schwanz in Ihre Richtung. In diesem Stadium ist der Embryo das Rückenmark deutlich zu erkennen. Daher sind keine gegensätzlichen Techniken erforderlich. Das Rückenmark ist an beiden Enden, der Kopf und der Schwanz dicht, aber wenn Ihr Mikrokapillare ist dünn genug, werden Sie in der Lage, Punktion ein kleines Loch und durchdringen das Neuralrohr in einem flachen Winkel. Ein Mikrokapillare der richtige Durchmesser sollten leicht geladen werden mit DNA, dringen in die Röhre, ohne es zu beschädigen und lassen Sie die DNA mit einem regelmäßigen Ausatmen. </li><li> Spritzen Sie die DNA mit einem Mund pipettieren. Der grüne Farbstoff sollte von der Spitze des Schwanzes bis zu den Vesikeln des sich entwickelnden Gehirns verteilt. </li><li> Platzieren Sie die Elektroden parallel zu den Neuralrohrdefekten, so nah wie du kannst, ohne sie zu berühren das Rohr selbst und Puls. Zum Zeitpunkt des Pulses, müssen die Elektroden mit flüssigem dafür, dass die elektrische Leitfähigkeit abgedeckt werden. Normalerweise ist die Menge an Hank ist am Betteln hinzugefügt ausreichend. Wenn nicht einen Tropfen Hank ist nur vor dem Impuls. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und dichten die Fenster mit einem Klebeband. Es ist wichtig, um das Ei ganz Dichtung zu verhindern Trocknung des Embryos während der folgenden Inkubationszeit. </li><li> Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator. </li></ol> II. Rückenmark open-book Vorbereitung Detachment des Rückenmarks aus dem Embryo <ol><li> Entfernen Sie die eletroporated Embryo, bei E6, aus dem Ei und legen Sie sie in einer Petrischale mit Silikon mit PBS beschichtet. </li><li> Schneiden Sie die Membranen und strecken den Embryo auf seine Bauchseite mit Stiften, es zu halten. </li><li> Mit einem scharfen Wolfram Mikrokapillare einen Längsschnitt entlang der Dachplatte aus dem Hinterhirn bis zum Schwanz. </li><li> Machen Sie zwei zusätzliche Längs-Schnitte an beiden Seiten des Rückenmarks, Ablösen der Spinalganglien (DRG) vom Rückenmark. </li><li> Lösen Sie die Bodenplatte aus dem Gewebe ab dem Schwanz auf die Hinterhirn, so dass das Rückenmark intakt. </li><li> Cut das Rückenmark in einem Querschnitt an der Hinterhirn mit einer feinen Schere und trennte es aus dem Körper. </li></ol> Fixierung <ol><li> Verbreiten Sie die isolierten Rückenmark in eine neue Petrischale mit Silikon enthält PBS, mit Stiften, es zu halten, aus dem Hinterhirn bis zum Schwanz Herstellung einer flachen-mount Präparat beschichtet. </li><li> Gießen Sie die PBS von der Schale und ersetzen Sie es mit 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li></ol> Immunhistochemie <ol><li> Übertragen Sie die feste Rückenmark in eine Flasche mit primärem Antikörper in PBS. </li><li> Inkubieren mit sanften Aufregungen über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Antikörper X5 mal mit PBS, jeder Wäsche für 1 Stunde mit leichten Erschütterungen. </li><li> Add sekundären Antikörper und Inkubation mit sanften Aufregungen über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Antikörper X5 mal mit PBS, die jeweilsWaschen für 1 Stunde mit leichten Erschütterungen. </li></ol> Montage offenes Buch für die Bildgebung <ol><li> Smear Fett oder Silikon in eine rechteckige Form auf einer Folie und tropft PBS innen. </li><li> Legen Sie das Rückenmark in der Mitte des Rechtecks ​​mit einer Pinzette und ziehen Sie die Flüssigkeit um es mit einer Pasteurpipette gestreckt. </li><li> Legen Sie 1-2 Tropfen Eindeckmittel auf das Rückenmark und Deckel mit Deckglas. Squash es zu vermeiden, Luftblasen. </li><li> Halten Sie die Folien in dunklen in 4 ° C. </li><li> Überprüfen Sie das Rückenmark mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

Elektroporation von Plasmid-DNA in das Hühnerembryo entwickelt sich als eine leistungsstarke Technik für in vivo ektopische Expression. Die Kombination von spezifischen Enhancer und chick Elektroporation bietet eine schnelle und effiziente Werkzeug für die Entschlüsselung axonalen Wege eines genetisch definierten Gruppe von Neuronen 1,3,5. Mit Hilfe des Cre / loxP und die Gal4/UAS Verstärkung Systeme ergänzen die Höhe und Dauer der Ausdruck. Das entstehende Bild ist von einem komplexen Divergenz der axonalen ...

die entzifferung axonal pathways von genetisch definierte gruppen von neuronen in der küken neuralrohr verwendung in ovo elektroporation

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Beschäftigung von Enhancer-Elemente zur Expression von Reporter-Gene in Nervenzellen Laufwerk ist ein weit verbreitetes Paradigma für die Verfolgung von axonalen Projektion. Für Tracking axonale Projektion der spinalen Interneuronen bei Wirbeltieren, Ertrag Keimbahn gezielte Reportergene bilateral symmetrische Kennzeichnung. Daher ist es schwer, zwischen dem ipsi-und contra-seitlich abstehende Axonen zu unterscheiden. Einseitige Elektroporation in das Küken Neuralrohr stellt ein nützliches Mittel, um die Expression eines Reportergens zu einer Seite des zentralen Nervensystems zu beschränken und axonale Projektion auf beiden Seiten folgen<sup&gt; 1 ,2-5</sup&gt;. Dieses Video zeigt zunächst, wie man die Eier vor der Injektion zu behandeln. In HH Stadium 18-20, DNA in die sakrale Ebene des Neuralrohrs eingespritzt wird, dann Wolfram-Elektroden sind parallel zu den Embryo gelegt und kurze elektrische Impulse werden mit einem Impulsgeber verwaltet. Das Ei ist mit Klebeband verschlossen und wieder in einen Inkubator für die weitere Entwicklung. Drei Tage später (E6) des Rückenmarks ist wie ein offenes Buch Vorbereitung von Embryo entnommen, fixiert und verarbeitet ganze Berg Antikörper-Färbung. Die Kirchenfenster Rückenmark ist am Schlitten montiert und visualisiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.

Dieses Video zeigt, wie axonale Wege der genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der embryonalen chick Rückenmark Nutzung visualisieren<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporation von Reporter-Gene unter der Kontrolle von spezifischen Enhancer-Elemente.

Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation

Die Verwendung von Enhancer-Elementen zur Steuerung der Expression von Reportergenen in Neuronen ist ein weit verbreitetes Paradigma zur Verfolgung axonaler Projektionen. Zur Verfolgung ...

Hallo, ich bin Ham aus dem Labor von Dr. Review Klar an der Abteilung für medizinische Neurobiologie der Hebräischen Universität von Jerusalem. Hallo, ich bin Sophie Esman und komme ebenfalls aus einem Lars-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren für Innovo, Elektroporation und die Vorbereitung des offenen Rückenmarks zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die axonalen Verläufe genetisch definierter neuronaler Populationen im embryonalen Rückenmark zu untersuchen. Beginnen wir also. Überführen Sie befruchtete Eier von weißen Leghorn-Hühnern zur Initiierung dieses Verfahrens von Raumtemperatur in einen befeuchteten Inkubator, vorzugsweise mit schaukelnden Einschüben, bei 37 bis 38 Grad Celsius.Es ist wichtig, die Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators zu überwachen, um lebensfähige und synchronisierte Embryonen zu erhalten. Die Hühnerembryonen werden elektroporiert, sobald sie den Hamburger-und-Hamilton- oder HH-Stadium 18 bis 20 erreicht haben, welches ein optimales Stadium für die expressionsabhängige Aktivität von Enhancern darstellt. Zu diesem Zeitpunkt liegt der Kopf im rechten Winkel zum Rumpf.Auch im HH-Stadium 18 bis 20 sollten umfangreiche extraembryonale Blutgefäße wie die vorderen, hinteren rechten und linken Vitellinliniengefäße sichtbar sein. Die Hühnerembryonen erreichen das HH-Stadium 19 bis 20 nach 66-stündiger Inkubation; zu diesem Zeitpunkt die Eier aus dem Inkubator nehmen. Nach dem Entfernen der Eier diese horizontal lagern und fünf bis zehn Minuten warten. Das Embryo befindet sich nun am oberen Pol des Eis.Vor der Elektroporation bereiten die Embryonen Hank’s Lösung mit 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin vor. Bereiten Sie eine gewünschte DNA-Mischung mit zwei bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter vor und geben Sie ein paar Körner des Fast-Green-Farbstoffs hinzu, um die injizierte DNA leicht sichtbar zu machen. Halten Sie eine Mundpipette, eine sterile Spritzennadel, kleine Schere und ein Klebeband bereit.Bereiten Sie Mikrokappillaren vor, indem Sie Glas-Kapillaren mit einem Durchmesser von 0,5 Millimeter mit einem Pipettenzuggerät ziehen. Setzen Sie die Wolframelektroden in die Mikromanipulatoren ein und verbinden Sie die Elektroden mit dem Impulsgenerator. Stellen Sie die Spannung am Impulsgenerator auf minus 30 Volt, die Dauer jedes Impulses auf 50 Millisekunden und die Anzahl der Impulse auf drei.Fahren Sie mit der Elektroporation fort, bevor die Embryonen exponiert und handhaben werden. Setzen Sie eine Spritze an dem schmalen Pol des Eis an und entnehmen Sie fünf bis sechs Milliliter Albumin aus jedem Ei. Das Albumin wird entfernt, um ein Verschütten zu vermeiden.Beim Schneiden im nächsten Schritt die kleinen Scheren zum Schneiden verwenden. Nach dem Freilegen des Hühnerembryos an der Oberseite des Eis ein ovales Fenster öffnen und dieses mit 0,5 bis einem Milliliter Hank’s- und Penicillin-Streptomycin-Lösung befeuchten. Danach mit einer Mundpipette die Glas-Mikrokappe füllen.Mit einer DNA-Färbelösung sollte eine Mikrokapi­llare mit dem richtigen Durchmesser problemlos mit DNA befüllbar sein. Positionieren Sie unter dem Binokular das Embryo so, dass die DNA in den Neuralrohrabschnitt injiziert werden kann. Stellen Sie das Embryo mit dem Schwanzende zu sich hin.In diesem Entwicklungsstadium ist das Rückenmark deutlich sichtbar, sodass keine Kontrastierungsverfahren erforderlich sind. Das Rückenmark ist an beiden Enden, am Kopf- und am Schwanzende, verschlossen. Bei mikrokapillaren Einstichen sollten jedoch mehrere Löcher in den Neuralrohr hinein und unter flachem Winkel erfolgen; eine Mikrokapillare, die dünn genug und von korrektem Durchmesser ist, sollte das Rohr durchdringen, ohne es zu beschädigen.Injizieren Sie die DNA mithilfe einer Mundpipette. Eine Mikrokappe mit dem richtigen Durchmesser sollte die DNA bei gleichmäßigem Ausatmen freisetzen. Der grüne Farbstoff sollte sich von der Schwanzspitze bis zu den Vesikeln des sich entwickelnden Gehirns ausbreiten.Spritzen Sie ein, bis der Neuralrohr mit DNA gefüllt ist. Die Elektroporation ist erforderlich, damit die injizierte DNA in die Zellen eindringen kann. Zuerst platzieren Sie die Elektroden parallel zum Neuralrohr und so nah wie möglich daran, ohne das Rohr selbst zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden mit Flüssigkeit bedeckt sind, um die elektrische Leitfähigkeit während des Impulses zu gewährleisten.Normalerweise genügt die Hank-Lösung, die unmittelbar nach der Exposition des Embryos hinzugefügt wird. Falls dies nicht der Fall ist, geben Sie einen Tropfen Hank-Lösung hinzu, kurz bevor der Puls erfolgt, wobei die Elektroden positioniert und in der Flüssigkeit untergetaucht sind, um den Elektropuls durchzuführen. Entfernen Sie danach vorsichtig die Elektroden und verschließen Sie das Fenster sowie das Ei mit Klebeband. Es ist wichtig, das Ei vollständig abzudichten, um ein Austrocknen des Embryos während der anschließenden Inkubationsphase zu verhindern.Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator und inkubieren Sie es, bis das Hühnerembryo den embryonalen Entwicklungstag sechs oder E sechs erreicht hat, zu dem Zeitpunkt, zu dem die Bildgebung erfolgen soll. Wenn das elektroporierte Embryo den embryonalen Entwicklungstag sechs, E sechs, drei Tage nach der Elektroporation erreicht hat, nehmen Sie es aus dem Ei heraus und legen Sie es mit feinen Scheren in eine mit Silikon beschichtete Petrischale, die PBS enthält.Schneiden Sie die Membranen ab und spannen Sie das Embryo auf der Bauchseite mithilfe von Nadeln, die in die Silikonmasse gesteckt werden, um es zu fixieren. Verwenden Sie eine scharfe Wolfram-Mikrokapi­llare, um einen longitudinalen Schnitt entlang der Dachplatte vom Nachhirn bis zum Schwanzansatz durchzuführen.Erstellen Sie zwei zus&auml;tzliche l&auml;ngs verlaufende Inzisionen auf beiden Seiten des R&uuml;ckenmarks, um die dorsalen Wurzelganglien oder DRGs vom R&uuml;ckenmark zu l&ouml;sen. L&ouml;sen Sie die Bodenplatte vom Gewebe ausgehend vom Schwanz bis zum Hinterhirn, wobei das R&uuml;ckenmark intakt bleibt. Schlie&szlig;lich schneiden Sie mit feiner Schere das R&uuml;ckenmark im Querschnitt am Hinterhirn durch und trennen Sie das R&uuml;ckenmark vom K&ouml;rper ab.Nachdem nun das Rückenmark isoliert wurde, breiten Sie es in einer neuen, silikonbeschichteten Petrischale, die PBS enthält, unter Verwendung von Nadeln aus, wobei das Rückenmark vom Hinterhirn bis zum Schwanz fixiert wird, um eine flache Präparation herzustellen. Fixieren Sie das Rückenmark eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd in PBS, gefolgt von der Immunfärbung gemäß dem detaillierten und beigefügten schriftlichen Protokoll zur offenen Montage des Rückenmarks. Buchpräparation zur Bildgebung.Verteilen Sie Vaseline oder Silikon in rechteckiger Form auf einem Objektträger und geben Sie PBS-Tropfen innerhalb des Rechtecks hinzu. Platzieren Sie mit einer Pinzette das Rückenmark in der Mitte des Rechtecks, strecken Sie es und entfernen Sie die umgebende Flüssigkeit. Geben Sie mit einer feinen Pipette ein bis zwei Tropfen Einbettmedium auf das Rückenmark und decken Sie es mit einem Deckglas ab.Üben Sie Druck auf die Deckglas aus, um Luftblasen zu vermeiden. Bewahren Sie die Objektträger im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf.Untersuchen Sie das Rückenmark mithilfe der konfokalen Mikroskopie. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse zur axonalen Abstoßung von Interneuronen des Hühner-Rückenmarks in Kontrollexperimenten, bei denen RFP in allen Neuronen unter Verwendung eines ubiquitären Enhancerelements aus CMV exprimiert wird. Die meisten Neuronen und ihre Axone sind markiert. Es ist unmöglich, die axonalen Verläufe neuronaler Subpopulationen zu entschlüsseln.Jedoch wird bei Anwendung spezifischer Enhancerelemente ein definierter axonaler Verlauf einer spezifischen Teilpopulation von DI-Neuronen in diesem Beispiel sichtbar. Wir haben Ihnen also gerade gezeigt, wie man bei E drei einen Kiefer-Neuralrohrabschnitt mit einem spezifischen neuronalen Enhancer elektroporiert und wie man bei E sechs ein offenes Buch-Rückenmark präpariert. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, sollten Sie stets vorsichtig und geduldig sein.Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Viel Erfolg.

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Forschung

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