Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation
May 2nd, 2010
Dieses Video zeigt, wie axonale Wege der genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der embryonalen chick Rückenmark Nutzung visualisieren In ovo Elektroporation von Reporter-Gene unter der Kontrolle von spezifischen Enhancer-Elemente.
Hallo, ich bin Ham aus dem Labor von Dr.Review Klar an der Abteilung für medizinische Neurobiologie an der Hebräischen Universität Jerusalem. Hallo, ich bin Sophie Esman und komme auch aus einem Lars-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Innovo, Elektroporation und Aufbereitung des offenen Buches des Rückenmarks.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um axonale Trajektorien genetisch definierter neuronaler Populationen im embryonalen Rückenmark zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie befruchtete weiße Leghorn-Hühnereier von Raumtemperatur in einen befeuchteten Brutkasten um, vorzugsweise mit Schaukelschalen bei 37 bis 38 Grad Celsius.
Es ist wichtig, die Temperatur und Luftfeuchtigkeit des Inkubators zu überwachen, um lebensfähige und synchronisierte Embryonen zu erhalten. Die Hühnerembryonen werden elektroporiert, wenn sie das Hamburger- und Hamilton- oder HH-Stadium 18 bis 20 erreicht haben, was ein optimales Stadium für die spezifische Expression der Enhancerabhängigkeit ist. In diesem Stadium liegt der Kopf im rechten Winkel zum Rumpf.
Auch im HH-Stadium 18 bis 20 sollte eine große Anzahl von extraembryonalen Blutgefäßen wie die vorderen, hinteren rechten und linken Vitalliniengefäße zu sehen sein. Die Hühnerembryonen erreichen nach 66 Stunden Inkubation das HH-Stadium 19 bis 20 und nehmen zu diesem Zeitpunkt die Eier aus dem Brutkasten. Nachdem Sie die Eier entnommen haben, legen Sie sie waagerecht und warten Sie fünf bis 10 Minuten. Der Embryo befindet sich nun am oberen Pol der Eizelle.
Vor dem Elektropering bereiten die Embryonen die Hank-Lösung mit 100 Einheiten Penicillin pro Milliliter und 0,1 Milligramm pro Milliliter Streptomycin vor. Bereiten Sie eine gewünschte DNA-Mischung mit zwei bis fünf Mikrogramm pro Mikroliter vor und fügen Sie einige Körner des schnellen grünen Farbstoffs hinzu, um die injizierte DNA leicht sichtbar zu machen. Halten Sie auch eine Mundpipette, eine sterile Spritzennadel, eine kleine Schere und ein Klebeband bereit.
Bereiten Sie Mikrokapillaren vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Pipettenabzieher mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern ziehen. Setzen Sie die Wolframelektroden in die Mikromanipulatoren ein und verbinden Sie die Elektroden mit dem Impulsgenerator. Stellen Sie die Spannung am Impulsgeber auf minus 30 Volt, die Länge jedes Impulses auf 50 Millisekunden und die Anzahl der Impulse auf drei ein.
Fahren Sie mit der Elektroporation fort, bevor Sie die Embryonen freilegen und handhaben. Führen Sie eine Spritze in den schmalen Pol des Eies ein und entfernen Sie fünf bis sechs Milliliter Albumin aus jedem Ei. Das Albumin wird entfernt, um ein Verschütten zu verhindern.
Beim Schneiden im nächsten Schritt schneidest du mit der kleinen Schere zu. Öffnen Sie ein ovales Fenster an der Oberseite des Eies, nachdem Sie den Hühnerembryo freigelegt haben, befeuchten Sie es mit 0,5 bis einem Milliliter Strängen und Penicillin-Streptomycin-Lösung. Verwenden Sie anschließend einen Mundperpet, um die Mikrokapillare des Glases zu laden.
Bei einer DNA-Farbstoffmischung sollte eine Mikrokapillare mit dem richtigen Durchmesser leicht mit DNA beladen werden. In binokularer Position wird der Embryo zur Injektion der DNA in das Neuralrohr gehalten. Platzieren Sie den Embryo mit dem Schwanz in Ihre Richtung.
In diesem Entwicklungsstadium ist das Rückenmark deutlich sichtbar und daher sind keine Kontrasttechniken erforderlich. Das Rückenmark ist sowohl am Kopf als auch am Schwanzende verschlossen. Da die Mikrokapillare jedoch mehr Löcher in das Neuralrohr einsticht und es in einem flachen Winkel durchdringt, sollte eine Mikrokapillare, die dünn genug und mit dem richtigen Durchmesser ist, das Rohr durchdringen, ohne es zu beschädigen.
Injizieren Sie die DNA mit einem Mundperpet. Eine Mikrokapillare mit dem richtigen Durchmesser sollte die DNA mit regelmäßiger Ausatmung freisetzen. Der grüne Farbstoff sollte sich von der Spitze des Schwanzes bis zu den Vesikeln des sich entwickelnden Gehirns ausbreiten.
Injizieren, bis das Neuralrohr mit DNA gefüllt ist, ist eine Elektroporation erforderlich, damit die injizierte DNA zuerst in die Zellen gelangen kann. Platzieren Sie die Elektroden parallel zum Neuralrohr und so nah wie möglich daran, ohne das Rohr selbst zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden mit Flüssigkeit bedeckt sind, um die elektrische Leitfähigkeit während des Impulses zu ermöglichen.
In der Regel ist die Hank-Lösung, die unmittelbar nach der Exposition des Embryos hinzugefügt wird, ausreichend. Aber wenn nicht ein Tropfen von Hanks Lösung kurz vor dem Impuls mit den Elektroden positioniert und in den flüssigen Impuls getaucht wird, um zu arbeiten, dann entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und versiegeln Sie das Fenster und das Ei mit Klebeband. Es ist wichtig, die Eizelle vollständig zu versiegeln, um ein Austrocknen des Embryos während der folgenden Inkubationszeit zu verhindern.
Legen Sie das Ei zurück in den Brutkasten und inkubieren Sie, bis der Hühnerembryo den Entwicklungsembryonal erreicht. Tag sechs oder E sechs, wenn es Zeit für die Bildgebung ist, wenn der elektroporierte Embryo das Entwicklungsstadium des Embryos erreicht hat. Tag sechs, E sechs drei Tage nach der Elektroporation, nehmen Sie es aus dem Ei und legen Sie es mit einer feinen Schere in eine silikonbeschichtete Petrischale, die PBS enthält.
Schneiden Sie die Membranen ab und dehnen Sie den Embryo auf seiner Bauchseite, indem Sie Stecknadeln verwenden, die in das Silikon geschoben werden, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Mit einer scharfen Wolfram-Mikrokapillare. Machen Sie einen längsitudalen Schnitt entlang der Dachplatte vom Hinterhirn bis zum Schwanz.
Machen Sie zwei zusätzliche Längsschnitte auf beiden Seiten des Rückenmarks, wobei Sie die Spinalganglien oder DRGs vom Rückenmark lösen. Löse die Bodenplatte vom Gewebe beginnend vom Schwanz bis zum Hinterhirn und lasse das Rückenmark intakt. Zum Schluss schneidest du mit einer feinen Schere das Rückenmark in einem Querschnitt am Hinterhirn ab und trennst das Rückenmark vom Körper.
Jetzt, da das Rückenmark isoliert wurde, verteilen Sie es in einer neuen, mit Silikon beschichteten Petrischale, die PBS enthält, mit Stiften, die es vom Hinterhirn zum Schwanz halten, wodurch ein flaches Präparat entsteht. Fixieren Sie das Rückenmark eine Stunde lang in 4%igem Paraldehyd in PBS bei einer Immunfärbung bei Raumtemperatur nach dem immunhistochemischen Verfahren, einem detaillierten und begleitenden schriftlichen Protokoll zur Öffnung des Rückenmarks. Buchvorbereitung für die Bildgebung.
Verteilen Sie Fett oder Silikon in rechteckiger Form auf einer Folie und tropfen Sie PBS in das Rechteck. Lege das Rückenmark mit einer Pinzette an, dehne die Mitte des Rechtecks und ziehe die Flüssigkeit um das Rückenmark herum heraus. Bei einer Pasta pro Haustier ein bis zwei Tropfen Eindeckmittel auf das Rückenmark geben und mit einem Deckglas abdecken.
Üben Sie Druck auf das Deckglas aus. Zur Vermeidung von Luftblasen. Bewahren Sie die Dias dunkel bei vier Grad Celsius auf.
Untersuchen Sie das Rückenmark mit der konfokalen Mikroskopie. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der axonalen Abstoßung von Spinalinterneuronen von Küken in Kontrollexperimenten, bei denen RFP in allen Neuronen exprimiert wird, die ein ubiquitäres Enhancer-Element von CMV verwenden, die meisten Neuronen und ihre Axone sind markiert. Es ist unmöglich, die axonale Bahn neuronaler Subpopulationen zu entschlüsseln.
Bei der Anwendung spezifischer Verstärkungselemente wird jedoch ein definierter axonaler Weg einer spezifischen Subpopulation DI zwei Neuronen in diesem Beispiel aufgedeckt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Neuralrohr auf der Wange mit einem spezifischen neuronalen Enhancer bei E drei elektro operiert und wie man ein offenes Buch Rückenmark bei E sechs präpariert. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, sollten Sie daran denken, vorsichtig und geduldig zu sein.
Das ist es also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Viel Glück.
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Übersicht
Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Visualisierung axonaler Bahnen von genetisch definierten Neuronen im embryonalen Hühnchen-Rückenmark mittels in ovo Elektroporation. Die Methode ermöglicht es Forschern, axonale Bahnen effektiv zu untersuchen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Das Verständnis axonaler Bahnen ist entscheidend für die neurowissenschaftliche Forschung.
- In ovo Elektroporation ist eine Technik zur Einführung von Reportergenen.
- Das embryonale Hühnchen-Rückenmark dient als Modell zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung.
- Genetisch definierte neuronale Populationen können Einblicke in spezifische neuronale Schaltkreise geben.
Zweck der Studie
- Zur Visualisierung axonaler Bahnen im embryonalen Rückenmark.
- Zur Nutzung der in ovo Elektroporation für Genexpressionsstudien.
- Zur Verbesserung des Verständnisses der neuronalen Entwicklung und Konnektivität.
Verwendete Methoden
- Transfer befruchteter Hühnereier in einen befeuchteten Inkubator.
- Inkubation bei 37 bis 38 Grad Celsius beibehalten.
- Durchführen von in ovo Elektroporation zur Einführung von Reportergenen.
- Vorbereitung von Rückenmark-"Open Book"-Präparationen zur Visualisierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung axonaler Bahnen im Rückenmark.
- Demonstration der Effektivität der in ovo Elektroporation.
- Einblicke in die Bahnen genetisch definierter neuronaler Populationen.
- Etablierung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die neurowissenschaftliche Forschung.
- In ovo Elektroporation ist effektiv für die Genlieferung in embryonalen Modellen.
- Das Verständnis axonaler Bahnen kann Studien zur Bildung neuronaler Schaltkreise unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
