Name: Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Lernen Sie die Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) für Angiogenese-Forschung. Dieses Protokoll zeigt die Kollagenase-basierte Gewinnung aus Nabelschnurvenen für in-vitro-Experimente.

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Verfahren <ol><li> Lay Schnur auf saubere Unterlage und tupfen Sie überschüssiges Blut. Machen Sie frische Schnittwunden an beiden Enden der Schnur. </li><li> Einsatz 21 2.1 G Nadel mit dem Kunststoff Injektionsnadelhülle ON, in die Vene. (Die Vene wird die größte Öffnung, die 2 kleineren sind Arterien) </li><li> Klemmen Sie die Nadel im Ort mit einem hemostat und befestigen Sie die 20cc Spritze Hanks an der Nadel. </li><li> Drücken Sie die Hanks durch die Vene mit mäßigem Druck. Sammeln Sie die Abfälle in das Becherglas mit Bleichmittel. (Holding der Nadel und Schnur mit einer Hand, während Sie die Nadel mit Ausbrüchen aus der Vene verhindern würde.) Wenn es eine Menge Blut in der Vene, waschen ein zweites Mal. </li><li> Lay Schnur am Pad und klemmen Sie das andere Ende der Vene. Füllen Sie mit ein paar ml Hanks auf Lecks an der Schnur zu überprüfen. Ziehen Sie die 5 mL und ziehen Sie den unteren Klemme. </li><li> Trennen Sie die 20cc Spritze. Entfernen Sie den Kolben aus der 10cc Spritze. Bringen 10cc Spritze Nadel, pour in 10ml Kollagenase und ersetzen Kolben. Push-Kollagenase in die Vene, bis Sie die erste Ausfahrt Menge das offene Ende. Re-clamp das offene Ende und füllen sich mit Kollagenase, bis es moderate Ausdehnung der Vene. Zu viel distention Ergebnisse in der glatten Muskulatur Kontamination. </li><li> Massage der Schnur sanft. </li><li> Inkubieren Kabel (mit Arterienklemmen, Nadel und Spritze befestigt) in DPBS bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Während der Inkubation weiterhin die Schritte 1-8 mit 2 nd Kabel. </li><li> Nach der Inkubation nehmen Schnur von Becher und bei gedrückter Schnur über die 50ml Tube geschnitten Ende über dem Boden befestigen. Achten Sie darauf, alles in der Röhre zu sammeln. Schieben Sie die restlichen Kollagenase durch die Schnur, dann bringen Sie die 20cc Spritze und drücken Hanks durch mit mäßigem Druck. </li><li> Wenn keine glatten Muskelzellen benötigt werden, verwerfen die Schnur zu diesem Zeitpunkt. Andernfalls setzen die gleichen Kabel in einem zweiten 50 mL Röhrchen mit 5ml ~ Kollagenase und bei 37 ° C für 30-60 min. </li><li> Halten Sie das Rohr, bis alle Kabel fertig sind. </li><li> Spin-Röhrchen bei ~ 1200 rpm für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand (mit Ausnahme von ~ 1-2 mL). Pellet in 5mls PHEC + und Platte in einer T25. </li><li> Bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag entfernen Überstand und ersetzen mit frischen Medien. Wenn es viele Erythrozyten sind, einmal abwaschen mit M199, dann fügen Sie PHEC +. Weiter Inkubation wie gewohnt, bis die Platte ist konfluent (1-4 Tage). Aufgeteilt in eine gelatinierte T75. </li><li> Sobald T75 ist konfluent, aufgeteilt in drei T75s. Einfrieren zwei Fläschchen pro Flasche. </li></ol> Hinweis: Endothelzellen (nicht aktivierte) haben einen gepflasterten Aussehen. Endothelzellen sind manchmal aktiviert (lang und spitz) direkt nach Isolation, nach ein paar Durchgängen sie in der Regel in eine unactive Zustand zurückzukehren. Cleanup <ol><li> Sehr vorsichtig, von Nadeln in Entsorgungsboxen entsorgen. </li><li> Entsorgen von Spritzen in großen Behälter für biologischen. </li><li> Legen Sie alle Gewebe in kleine Beutel für biologisches Risikomaterial. Close Tasche und bei -20 ° bis Verbrennung. </li><li> Weichen Sie alle Instrumente in viruzid für mindestens 10 min. </li><li> Add Inkubation Medien / Bleiche Becher Abfall. Lassen Sie sitzen für mindestens 10 min. </li><li> Entsorgen Sie die Bank-Pads in biohazard Abfall. </li><li> Spray auf der Innen-und Außenseite Becher, Arbeitstisch und im Wasserbad Deckel mit vircide. Lassen Sie sitzen 10 min, dann wischen. </li><li> Spülen Sie Becher und Instrumente mit warmem Wasser und hängen am Regal zum Trocknen (abtupfen die Instrumente, damit sie nicht rosten). </li><li> Entsorgen dekontaminiert Abfälle in den Ausguss. </li><li> Nicht verwendete Medien Kühlschrank. </li><li> Entsorgen von Handschuhen in biohazard Abfall. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>0,1 % Kollagenase </td><td></td><td></td><td>10 mL pro Nabelschnur, auf 37 &amp;deg;C erwärmt</td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td></td><td></td><td>T75, eine pro Nabelschnur.</td></tr><tr><td>Hanks-Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>50-mL-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung humaner nabelschnur-endothelzellen (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem in Reaktion auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Hier zeigen wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese, und, noch wichtiger die Gefäße Display Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. Schiffe können leicht durch Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden, und erholte sich in reiner Form für nachgelagerte Anwendungen.

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Die Angiogenese ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, bei dem als Reaktion auf angiogene Stimuli neue Gefäße aus der bestehenden Vaskulatur gebildet werden. Diese Schritte ...

Hi, mein Name ist Jager Davis und heute zeige ich Ihnen, wie man humane endotheliale Nabelvenen-Zellen, auch bekannt als HUVECs, isoliert. Wir verwenden eine Reihe von Medien: Zunächst Hank’s Buffered Salt Solution, die dazu dient, die Zellen von roten Blutkörperchen oder anderen Verunreinigungen in der Vene zu befreien. Zweitens verwenden wir Kollagenase, die in DPBS resuspendiert ist. Diese Lösung dient dazu, die HUVECs aus der Vene zu lösen. Anschließend werden wir die Zellen in 20 % Effekt-Medium ausplattieren, einem M199-Medium, das mit wärmegedeaktiviertem FBS und Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde.Wir werden unsere Resus-Suspension außerdem mit einem endothelialen Zellwachstumszusatz von BD Biosciences ergänzen. Gut, ich habe ein Paar Präparierscheren. Ich werde einen geraden Schnitt durch die Nabelschnur wie folgt ausführen.Danach werde ich das Nabelband säubern. Dazu identifiziere ich die Arterien und die Vene. Es gibt zwei Arterien und eine Vene.Ich identifiziere die Arterien normalerweise paarweise. Sie verlaufen in Ihre Richtung. Wir haben hier also eine Arterie und direkt hier eine weitere.Und wie Sie sehen können, verläuft die Vene tatsächlich in Richtung der Nabel

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Nabelschnur werden verwendet, um Zellen der glatten Muskulatur durch verschiedene Arten zu isolieren. In dieser Arbeit verwendet die enzymatische Behandlung zu isolierten glatten Muskelzellen.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Protokolle für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die transiente Transfektion von fluoreszenzmarkierten Markern des Mikrotubuli-Wachstums, die Bildgebung lebender Zellen und die automatisierte Analyse der Wachstumsdynamik von Mikrotubuli zwischen den Phasen werden detailliert beschrieben.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.

Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.

Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Lernen Sie die Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) für Angiogenese-Forschung. Dieses Protokoll zeigt die Kollagenase-basierte Gewinnung aus Nabelschnurvenen für in-vitro-Experimente.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

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