Name: Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Lernen Sie die Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) für Angiogenese-Forschung. Dieses Protokoll zeigt die Kollagenase-basierte Gewinnung aus Nabelschnurvenen für in-vitro-Experimente.

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Verfahren <ol><li> Lay Schnur auf saubere Unterlage und tupfen Sie überschüssiges Blut. Machen Sie frische Schnittwunden an beiden Enden der Schnur. </li><li> Einsatz 21 2.1 G Nadel mit dem Kunststoff Injektionsnadelhülle ON, in die Vene. (Die Vene wird die größte Öffnung, die 2 kleineren sind Arterien) </li><li> Klemmen Sie die Nadel im Ort mit einem hemostat und befestigen Sie die 20cc Spritze Hanks an der Nadel. </li><li> Drücken Sie die Hanks durch die Vene mit mäßigem Druck. Sammeln Sie die Abfälle in das Becherglas mit Bleichmittel. (Holding der Nadel und Schnur mit einer Hand, während Sie die Nadel mit Ausbrüchen aus der Vene verhindern würde.) Wenn es eine Menge Blut in der Vene, waschen ein zweites Mal. </li><li> Lay Schnur am Pad und klemmen Sie das andere Ende der Vene. Füllen Sie mit ein paar ml Hanks auf Lecks an der Schnur zu überprüfen. Ziehen Sie die 5 mL und ziehen Sie den unteren Klemme. </li><li> Trennen Sie die 20cc Spritze. Entfernen Sie den Kolben aus der 10cc Spritze. Bringen 10cc Spritze Nadel, pour in 10ml Kollagenase und ersetzen Kolben. Push-Kollagenase in die Vene, bis Sie die erste Ausfahrt Menge das offene Ende. Re-clamp das offene Ende und füllen sich mit Kollagenase, bis es moderate Ausdehnung der Vene. Zu viel distention Ergebnisse in der glatten Muskulatur Kontamination. </li><li> Massage der Schnur sanft. </li><li> Inkubieren Kabel (mit Arterienklemmen, Nadel und Spritze befestigt) in DPBS bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Während der Inkubation weiterhin die Schritte 1-8 mit 2 nd Kabel. </li><li> Nach der Inkubation nehmen Schnur von Becher und bei gedrückter Schnur über die 50ml Tube geschnitten Ende über dem Boden befestigen. Achten Sie darauf, alles in der Röhre zu sammeln. Schieben Sie die restlichen Kollagenase durch die Schnur, dann bringen Sie die 20cc Spritze und drücken Hanks durch mit mäßigem Druck. </li><li> Wenn keine glatten Muskelzellen benötigt werden, verwerfen die Schnur zu diesem Zeitpunkt. Andernfalls setzen die gleichen Kabel in einem zweiten 50 mL Röhrchen mit 5ml ~ Kollagenase und bei 37 ° C für 30-60 min. </li><li> Halten Sie das Rohr, bis alle Kabel fertig sind. </li><li> Spin-Röhrchen bei ~ 1200 rpm für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand (mit Ausnahme von ~ 1-2 mL). Pellet in 5mls PHEC + und Platte in einer T25. </li><li> Bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag entfernen Überstand und ersetzen mit frischen Medien. Wenn es viele Erythrozyten sind, einmal abwaschen mit M199, dann fügen Sie PHEC +. Weiter Inkubation wie gewohnt, bis die Platte ist konfluent (1-4 Tage). Aufgeteilt in eine gelatinierte T75. </li><li> Sobald T75 ist konfluent, aufgeteilt in drei T75s. Einfrieren zwei Fläschchen pro Flasche. </li></ol> Hinweis: Endothelzellen (nicht aktivierte) haben einen gepflasterten Aussehen. Endothelzellen sind manchmal aktiviert (lang und spitz) direkt nach Isolation, nach ein paar Durchgängen sie in der Regel in eine unactive Zustand zurückzukehren. Cleanup <ol><li> Sehr vorsichtig, von Nadeln in Entsorgungsboxen entsorgen. </li><li> Entsorgen von Spritzen in großen Behälter für biologischen. </li><li> Legen Sie alle Gewebe in kleine Beutel für biologisches Risikomaterial. Close Tasche und bei -20 ° bis Verbrennung. </li><li> Weichen Sie alle Instrumente in viruzid für mindestens 10 min. </li><li> Add Inkubation Medien / Bleiche Becher Abfall. Lassen Sie sitzen für mindestens 10 min. </li><li> Entsorgen Sie die Bank-Pads in biohazard Abfall. </li><li> Spray auf der Innen-und Außenseite Becher, Arbeitstisch und im Wasserbad Deckel mit vircide. Lassen Sie sitzen 10 min, dann wischen. </li><li> Spülen Sie Becher und Instrumente mit warmem Wasser und hängen am Regal zum Trocknen (abtupfen die Instrumente, damit sie nicht rosten). </li><li> Entsorgen dekontaminiert Abfälle in den Ausguss. </li><li> Nicht verwendete Medien Kühlschrank. </li><li> Entsorgen von Handschuhen in biohazard Abfall. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>0,1 % Kollagenase </td><td></td><td></td><td>10 mL pro Nabelschnur, auf 37 &amp;deg;C erwärmt</td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td></td><td></td><td>T75, eine pro Nabelschnur.</td></tr><tr><td>Hanks-Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>50-mL-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung humaner nabelschnur-endothelzellen (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem in Reaktion auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Hier zeigen wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese, und, noch wichtiger die Gefäße Display Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. Schiffe können leicht durch Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden, und erholte sich in reiner Form für nachgelagerte Anwendungen.

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Die Angiogenese ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, bei dem als Reaktion auf angiogene Stimuli neue Gefäße aus der bestehenden Vaskulatur gebildet werden. Diese Schritte ...

Hi, mein Name ist Jager Davis und heute zeige ich Ihnen, wie man humane endotheliale Nabelvenen-Zellen, auch bekannt als HUVECs, isoliert. Wir verwenden eine Reihe von Medien: Zunächst Hank’s Buffered Salt Solution, die dazu dient, die Zellen von roten Blutkörperchen oder anderen Verunreinigungen in der Vene zu befreien. Zweitens verwenden wir Kollagenase, die in DPBS resuspendiert ist. Diese Lösung dient dazu, die HUVECs aus der Vene zu lösen. Anschließend werden wir die Zellen in 20 % Effekt-Medium ausplattieren, einem M199-Medium, das mit wärmegedeaktiviertem FBS und Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde.Wir werden unsere Resus-Suspension außerdem mit einem endothelialen Zellwachstumszusatz von BD Biosciences ergänzen. Gut, ich habe ein Paar Präparierscheren. Ich werde einen geraden Schnitt durch die Nabelschnur wie folgt ausführen.Danach werde ich das Nabelband säubern. Dazu identifiziere ich die Arterien und die Vene. Es gibt zwei Arterien und eine Vene.Ich identifiziere die Arterien normalerweise paarweise. Sie verlaufen in Ihre Richtung. Wir haben hier also eine Arterie und direkt hier eine weitere.Und wie Sie sehen können, verläuft die Vene tatsächlich in Richtung der Nabelschnur, und dort werden wir unsere Butterfly-Kanüle platzieren. Wir verwenden eine 21-Gauge- und-drei-Viertel-Accutane-Butterfly-Kanüle. Öffnen Sie sie daher.Einfach so hineingehen. Noch einmal, ich werde die Arterien identifizieren. Wir haben eine Arterie und die zweite Arterie, und dann ist da unsere Vene.Ich nehme nun die Butterfly-Kanüle und führe sie sehr vorsichtig in die Vene ein, allerdings kann ein gewisser Widerstand auftreten. Daher drehe ich das Venenkatheter-Set leicht und schiebe gleichzeitig die Kanüle vorwärts, mit einer solchen Bewegung, und fahre fort, bis die Flügel der Butterfly-Kanüle bündig mit dem Venenkatheter liegen, genau so. Und schon sind wir fertig – jetzt können wir es abklemmen.Was ich jetzt tun werde, ist, zwei 20-ml-Spritzen mit jeweils 20 ml Tinte zu füllen. Als Nächstes werde ich ein 50-ml-Kegelröhrchen mit fünf ml 20 % Effekt füllen. Danach werde ich 10 ml DPBS in eines dieser 15-ml-Kegelröhrchen pipettieren.Also diese 15 ml DPBS werde ich 10 Milligramm unseres Kollagenase-Pulvers hinzufügen, das ich auf einer Waage abwiegen werde. Ich werde die Kollagenase durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens resuspendieren, bis das Pulver von den Wänden des Röhrchens abgelöst ist. Etwa fünf- oder sechsmal. Danach werde ich die Kollagenase unter sterilen Bedingungen mit einer 10-ml-Spritze filtrieren, um den Filter zu befüllen.Und nun sind wir bereit, diese Medien durch das Kord zu geben. Ich habe das verbleibende DPPS in diesen einliterigen Becher gefüllt und werde ihn in das 37-Grad-Wasserbad stellen, damit es sich erwärmt. Dieses wird verwendet, um unser Kord etwa 15 Minuten lang zu inkubieren.Dies ist unsere gefilterte Kollagenase-Lösung. Ich werde dieses kegelförmige Gefäß in das 37-Grad-Wasserbad stellen, damit es sich erwärmt, und werde es später im Verfahren verwenden, um die Uvea von der Innenseite unserer Vene zu lösen. Als Nächstes werde ich die Nabelschnur an der Stelle der Butterfly-Nadel klemmen und 20 ml Hanks-Lösung durch die Nabelschnur leiten, um eventuelle Blutzellen auszuspülen.Nachdem ich die Butterfly-Kanüle befestigt habe, werde ich 20 ml unseres Hanks durchschleusen. Ich werde dies sehr langsam tun, um eine Beschädigung der Vene zu vermeiden. Und dies ist ungefähr die Geschwindigkeit, mit der es austritt, aber Sie sollten den Hanks nicht in Strömen fließen lassen.Das bedeutet, dass Sie zu stark drücken. Normalerweise mache ich es tropfenweise. Und erneut schiebe ich die Stränge durch, um die Vene zu reinigen.Und Sie exponieren unsere Endzellen. Danach haben wir alle unsere Hänge durchgeführt. Ich werde nun das Kabel ablegen und danach das untere Ende des Kabels abklemmen, die Spritze entfernen und es in einen Bioabfallsack einschließen.Als Nächstes werde ich eine neue 10-mil-Spritze anschließen. Gut, jetzt werde ich Kollagenase durch den Strang schieben, um eventuell in der Vene verbliebene Restbestände auszuspülen. Ich werde die Kollagenase gerade so viel durchschieben, wie nötig ist.Wenn es hier am Ende austritt, sehen wir etwa dieselbe Farbe wie in der Spritze. Danach werde ich das untere Ende des Strangs abklemmen. Als Nächstes werde ich etwas mehr Kollagenase durchschleusen, gerade genug, um eine Ausdehnung des Strangs beobachten zu können.Nachdem sich die Nabelschnur etwas ausgedehnt hat, werde ich sie nun massieren, und zwar von links nach rechts. Üblicherweise verwende ich drei Finger mit leichtem, aber festem Druck. Es ist ähnlich, wie wenn man Teig für Nudeln rollt.Sie sollten das Band nicht zu stark, aber auch nicht zu schwach ziehen. Wenn Sie zu stark ziehen, besteht die Gefahr einer Kontamination mit glattem Muskelgewebe. Wenn Sie jedoch zu sanft vorgehen, lösen Sie keinen der Q-Rückstände. Etwa fünf bis sechs Sekunden an einer Stelle verweilen und sich dann langsam nach unten vorarbeiten. Ich werde nun das Kabel vom Tisch in das 37-Grad-Wasserbad überführen und es 15 Minuten lang inkubieren lassen. Möglicherweise müssen Sie eine Probe 15 Minuten lang inkubieren.Ein weiterer Ansatz kann 20 Minuten betragen und ein dritter Ansatz könnte 10 Minuten betragen. Daher ist es wichtig, die Inkubationszeit für unseren speziellen Ansatz zu optimieren. Hier beträgt sie 15 Minuten.Wir werden nun unsere Kabel aus dem DPVS-Bad entfernen. Wir legen es hier kurz ab. Wir nehmen die Kappe von unserem 15-ml-Konikalgefäß ab, das unsere fünf ml 20 % Feck enthält.Der 20 % feck enthält einen Trypsininhibitor, weshalb er die Wirkung unseres Kollagenase stoppen wird. Daher halte ich nun die Schnur oberhalb des Reagenzglases mit unserer Schere fest. Als Nächstes werde ich entlang der Linie unserer Klemme schneiden.Sie bewegen den unteren Abschnitt hierher. Gut, jetzt haben wir einen frischen Schnitt am Ende unseres Strangs. Als Nächstes werde ich die Kollagenase durchstoßen.Und noch einmal, genau wie bei den Hanks, sollten Sie nicht zu schnell vorgehen. Dies ist die Geschwindigkeit, mit der Sie Ihr Medium durchstossen möchten. Damit ist die Behandlung mit Kollagenase abgeschlossen.Gelegentlich stellt man fest, dass die Spritze etwas zu fest befestigt ist. In solchen Fällen verwende ich die Klemme, die wir an unserem Nabelstrang hatten, greife damit einfach hierher und schraube vorsichtig und gerade genug, um sie zu lockern, sodass ich sie mit der Hand abnehmen oder sie sich löst. Als Nächstes nehme ich unsere verbleibende 20-mL-Spritze mit Hängs und befestige sie an unserer Nadel, und ich drücke das gesamte Volumen an Hängs durch.Auch hier werde ich wieder sehr langsam vorgehen, genau wie beim Kollagenase und der anderen Spritze mit Hanks – es kommt jetzt tropfenweise heraus. Dies ist ungefähr die Geschwindigkeit, mit der Sie das Medium durchdrücken sollten. Es enthält 20 % Effekt Hanks und unsere Kollagenase-Lösung.Was ich jetzt tun werde, ist, es in eine Zentrifuge zu geben und fünf Minuten bei 1200 U/min zu zentrifugieren. Ich werde noch einmal überprüfen, ob der Deckel sicher verschlossen ist. Unsere zwei, und ich werde es in unsere Zentrifuge stellen.Wir haben fünf Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Wir haben also unser 50-ml-Kegelröhrchen fünf Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Zurück bleibt ein kleines Pellet am Boden des Röhrchens. Dieses Pellet besteht aus verbliebenen roten Blutkörperchen und unseren endothelialen Zellen.Als Nächstes werde ich den Überstand abpipettieren, das Pellet in fünf Milliliter 20 %iger FBS aufnehmen und vorsichtig einige Male auf- und abpipettieren, bis kaum noch Partikel im Suspension sichtbar sind. Anschließend werde ich die gesamten fünf Milliliter auf eine T25-Flasche übertragen. Dabei achte ich darauf, keine Blasen zu erzeugen.Und ich werde nun mein ECPS hinzufügen. Ich gebe 50 µL hinzu und schwenke das Kolben vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich das ECPS gleichmäßig im Kolben verteilt. Das war's.Fortfahren. Das Kolben und 37 Grad inkubieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Nabelschnur werden verwendet, um Zellen der glatten Muskulatur durch verschiedene Arten zu isolieren. In dieser Arbeit verwendet die enzymatische Behandlung zu isolierten glatten Muskelzellen.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Dieses Protokoll wurde erstellt, um unsere Methode zur Isolierung von koronaren Endothelzellen von Mäusen zum Zwecke der Bildgebung oder zur Durchführung molekularbiologischer Experimente zu teilen.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Protokolle für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die transiente Transfektion von fluoreszenzmarkierten Markern des Mikrotubuli-Wachstums, die Bildgebung lebender Zellen und die automatisierte Analyse der Wachstumsdynamik von Mikrotubuli zwischen den Phasen werden detailliert beschrieben.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.

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Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

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Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Lernen Sie die Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) für Angiogenese-Forschung. Dieses Protokoll zeigt die Kollagenase-basierte Gewinnung aus Nabelschnurvenen für in-vitro-Experimente.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

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