Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

Für die Vernetzung, gefolgt von Immunpräzipitation. Zellen bei 80 bis 90 % Dichte werden mit einem millimolaren eiskalten DSP in PBS, Calcium, Magnesium oder DMSO inkubiert.

Vehicle-Kontrolle. DSP ist ein homo-bifunktioneller, membranpermeabler und reduzierbarer Vernetzer, der freie Aminogruppen miteinander verbindet, die weniger als 12 Ångström voneinander entfernt sind. Nach der Vernetzung werden die Zellen lysiert und Immunpräzipitationen unter Verwendung von Standardkontrollen durchgeführt.

Protein-Komplexe werden anschließend durch reduzierendes SDS-PAGE aufgetrennt, wobei reduzierende Agentien DSP spalten, sodass die Identifizierung einzelner Proteine durch Immunblotting ermöglicht wird. Hallo, ich bin Stephanie Ick aus dem Labor von Dr. Victor Fonde in der Abteilung für Zellbiologie an der Emory University. Und ich bin Pearl Ryder, ebenfalls aus dem Fonde-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Myprotein-Komplexen unter Verwendung kontrollierter Vernetzung, gefolgt von immunmagnetischer Affinitätschromatographie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um vorübergehende, labile Proteinwechselwirkungen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie damit, den Boden der Zellkulturplatten zu beschriften, um den Zelltyp und die spezifische Versuchsbedingung anzugeben. Ein positives Symbol hier zeigt DSP-behandelte Proben an, einschließlich einer negativen Kontrolle mit nur DMSO als Fahrzeugkontrolle. Geben Sie Medium zu den Platten hinzu, um sie für die Zellseeding-Platte vorzubereiten.

HEK-Zellen, die im Verdünnungsverhältnis 1:5 ausgesät wurden, um die Isolierung von 500 Mikrogramm Protein pro Standardröhrenreaktion zu ermöglichen. Ein einzelnes Röhrchen kann ausreichen, um die vermuteten Bindungspartner eines Proteins von Interesse durch Immunoblot aus der Massenspektrometrie-Analyse zu identifizieren. Erhöhen Sie die Anzahl der Standardreaktionen um mindestens das 10-Fache.

Bereiten Sie außerdem Stamm­lösungen der meisten in dem Vernetzungs­experiment verwendeten Lösungen vor. Dazu gehört PBS, der mit 0,1 Millimolar Calciumchlorid und einem Millimolar Magnesiumchlorid ergänzt ist und als PBS-Calcium-Magnesium bezeichnet wird. Die Zugabe von Calcium- und Magnesiumionen ist entscheidend für die Anheftung der Zellen an die Kulturplatte.

Während des Experiments die Lösung bei vier Grad Celsius lagern. Weitere Bestände umfassen die Quenchlösung für den Vernetzer, 50 X komplettes Proteaseinhibitorcocktail, das alle 20 Minuten vortexiert wird, bis der Pellet aufgelöst ist. 20 % Triton X-100, das bei vier Grad Celsius gelagert wird und innerhalb eines Monats verwendet werden sollte, sowie 10 x und 1 x Puffer A-Lösungen.

Bereiten Sie alle Lösungen gemäß des beigefügten schriftlichen Protokolls vor und lagern Sie sie entsprechend. Bereiten Sie abschließend den Lysepuffer, bestehend aus 1× Puffer A, 0,5 % TRITTON X-100, sowie den immunmagnetischen Präzipitationspuffer oder IP-Puffer, bestehend aus 1× Puffer, vor.

Fügen Sie 0,1 % TRITON X-101 hinzu. Zwei Tage nach der Aussaat weisen die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % auf, was optimal für die Vernetzung ist. Unter Bedingungen hoher Konfluenz neigen die Zellen dazu, sich übereinander zu lagern, wodurch die Zugänglichkeit des zellpermeablen Vernetzers für alle Zellen verringert wird. Stellen Sie die Platten zurück in den Inkubator, bis sie zur Vernetzung bereit sind.

Bereiten Sie die DSP-Vernetzerlösung unmittelbar vor der Anwendung auf die Zellen frisch zu. Da DSP stark hydrophob ist, wird es zunächst in DMSO auf eine Konzentration von 100 Millimolar gelöst, bevor es in den PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium verdünnt wird. Um die Verdünnung von DSP in den PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium weiter zu verbessern, erwärmen Sie ein geeignetes Volumen und geben 10 Mikroliter der DSP- und DMSO-Stammlösung hinzu.

Fügen Sie pro Milliliter warmes PBS mit Calcium und Magnesium die D-S-P-D-M-S-O-Stammlösung tropfenweise unter wiederholtem Mischen hinzu, bis sich das DSP vollständig aufgelöst hat. Bereiten Sie außerdem eine Fahrzeugkontrolllösung mit 10 Mikrolitern DMSO pro Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium vor. Nach der Verdünnung des DSP bewahren Sie alle PBS-Lösungen mit Calcium und Magnesium nicht länger als 10 Minuten in einem Eiswasserbad auf.

Bereiten Sie als Nächstes ein Eiswasserbad vor, das alle in dem Experiment verwendeten Platten aufnehmen kann. Entnehmen Sie die Kulturplatten mit den Zellen aus dem 37-Grad-Celsius-Inkubator und stellen Sie sie unverzüglich in das Eiswasserbad. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskalter PBS, die Calcium und Magnesium enthält, unter Verwendung der zuvor für die Inkubation mit dem Vernetzer vorbereiteten Volumina; für eine 6-Well-Platte berechnen Sie beispielsweise zwei Milliliter pro Vertiefung und entsprechend für andere Formate.

Nach der zweiten Wäsche. Geben Sie entweder die Fahrzeugkontrolle, also DMSO in Puffer gelöst, oder die DSP-Vernetzungspufferlösung zu den Zellen hinzu, inkubieren Sie zwei Stunden auf Eis und überprüfen Sie etwa alle 20 Minuten, ob alle Zellen von der Lösung bedeckt sind. Falls einige Zellen freiliegen, kippen und drehen Sie die Petrischale, um sie erneut gleichmäßig zu bedecken. Es ist normal, dass eine geringe Menge DSP ausfällt.

Während der zweistündigen Inkubation mit den Zellen, bevor die zweistündige Inkubation endet, bereiten Sie eine einprozentige DSP-Quenchlösung vor, indem Sie den Stamm in PBS mit Calcium und Magnesium verdünnen. Bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis auf, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, indem Sie das nicht reagierte DSP inaktivieren. Wenn die zwei Stunden abgelaufen sind, entfernen Sie die Fahrzeugkontrolle und die Vernetzungslösungen von den Zellen.

Geben Sie die eiskalte DSP-Aufhöslösung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit verdünnen Sie den kompletten Proteaseinhibitorcocktailstamm im Verhältnis 1 zu 50 in den Zelllysepuffer. Sobald die 15 Minuten abgelaufen sind, waschen Sie die Zellen zwei Mal mit PBS mit Calcium und Magnesium.

Anschießend den Lysepuffer mit den Proteaseinhibitoren zu den Zellen geben und 30 Minuten bei vier Grad Celsius schwenken. Nach 30-minütiger Zelllyse die Zellen mit einem Zellabstreifer von der Platte sammeln. Dabei sicherstellen, dass die Lysate auf Eis gehalten werden, um die Proteaseaktivität zu minimieren.

Zentrifugieren Sie die Zelllysate 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischminizentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit von 15.000 G. Pipettieren Sie den Überstand in ein frisches Gefäß und entsorgen Sie den Pellet. Analysieren Sie die Proteinkonzentrationen mittels Bradford-Assay und führen Sie anschließend die Immunpräzipitation durch. Beginnen Sie unmittelbar nach Starten der zweistündigen Vernetzungsreaktion in Schraubtopf-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Vorbereitungen für die Immunpräzipitation.

Mischen Sie 30 Mikroliter anti-IgG-Immungelbeads mit 500 Mikrolitern IP-Puffer. Geben Sie den Antikörper gegen das Zielantigen hinzu. Die geeignete Menge des Antikörpers sollte für jedes einzelne Antigen bestimmt werden.

In vorläufigen Experimenten umfassen mögliche negative Kontrollen für die Kügelchen: kein Antikörper, Kügelchen allein und Isotyp-Kontrollantikörper-Kügelchen, um den IP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen zu binden. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem Wipprührer mit Drehbewegung. Am Ende der Inkubation kurz zentrifugieren und die Röhrchen in den Magnetständer schieben. Die Kügelchen sammeln sich an der Seite des Magneten.

Entfernen Sie die Lösung mit den nicht gebundenen Antikörpern und waschen Sie die Perlen sofort, um zu verhindern, dass sie austrocknen. Nach zwei Waschschritten geben Sie 500 µL eines Lysats mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter an DSP-negativen oder DSP-positiven Zellen in die entsprechenden Röhrchen. Ein Peptid-Kompetitions-Negativkontrolle kann zu diesem Zeitpunkt vorbereitet werden, indem das immunogene Peptid in einer in Vorversuchen bestimmten Konzentration der Lysat-Perlen-Mischung zugegeben wird.

Eine weitere mögliche negative Kontrolle, die in diesem Schritt vorbereitet werden kann, ist eine Reaktion ohne Lysat, die durch Zugabe von nur 500 Mikrolitern Lysepuffer zu den Kügelchen hergestellt wird. Resuspendieren Sie die Kügelchen für die experimentellen und Kontrollreaktionen vorsichtig. Verwenden Sie keinen Vortex, da dies zum Zerbrechen der Kügelchen führen kann; inkubieren Sie stattdessen bei vier Grad mit end-over-end-Rotation für zwei Stunden.

Nach zwei Stunden das Lysat mithilfe des Magnetständer entfernen. Die Kügelchen kurz zentrifugieren und insgesamt sechs Mal mit je einem Milliliter IP-Puffer waschen. Jede Waschung fünf Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.

Um die gebundenen Komplexe zu lösen, geben Sie einen x-Gel-Probenpuffer in das IP-Röhrchen direkt über dem Perlenpellet hinzu. Um die Perlen am Boden des Röhrchens zu sammeln, klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens, um sicherzustellen, dass alle Perlen im Gel-Probenpuffer resuspendiert werden. Alternativ zur Immunaffinitätsisolierung werden 30 Mikroliter Puffer zugegeben, der mit dem immunogenen Peptid zu den Perlen ergänzt wurde.

Die erforderliche Konzentration des immunogenen Peptids wird empirisch bestimmt. Nachdem ein Bereich von 10 bis 200 Mikromolar getestet wurde, die Kügelchen zwei Stunden bei vier Grad inkubieren und die Röhrchen alle 30 Minuten vorsichtig schütteln. Mithilfe des Magnetständers die 30 Mikroliter, die die eluierten Komplexe enthalten, abnehmen und in einem sauberen Röhrchen aufbewahren; die Kügelchen mit IP-Puffer waschen und ebenfalls aufbewahren.

Geben Sie einen x-Gel-Probenpuffer zu den Perlen für beide Elutionsmethoden hinzu. Erhitzen Sie die immungemagnetischen Perlen, die in Gel-Probenpuffer resuspendiert wurden, zusätzlich zur Denaturierung der Proteine bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten. Dieser Schritt spaltet auch das DSP-Molekül, wodurch die einzelnen Proteine im Komplexlauf aufgetrennt werden können.

Die Proben auf einem SDS-Page-Gel für die Western-Blot-Analyse. Die entleerten immunmagnetischen Kügelchen können durch Zentrifugation abgetrennt und mithilfe eines Magnethalters vor dem Beladen aus der Probe entfernt werden. Wenn der immunaffine EUA sowohl durch Protein-Färbung mittels SDS-Page als auch durch Immunblots frei von IgG ist, eignet er sich für die Massenspektrometrie.

Hier ist ein Beispiel für eine Westernblot-Analyse von Material aus vernetzten und nicht vernetzten Zelllysaten, gefolgt von einer immunmagnetischen Präzipitation unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die AP-drei-Untereinheit. Die Delta-Vernetzung ermöglicht den Nachweis von wechselwirkenden Proteinen, die bei nicht vernetzten Proben während immunmagnetischer Isolierungen nicht sichtbar sind. Negative Kontrollen zeigten keinen spezifischen Proteinnachweis unter Verwendung einer antikörperfreien und einer isotypgepaßten Kontrolle mit einem IgG, das gegen den Transferrinrezeptor gerichtet ist, sowohl für nicht vernetzte als auch für vernetzte Proben.

In diesem Beispiel wurde eine Affinitätspeptidelution verwendet, um die an den IP-Antikörper gebundenen Proteine zurückzugewinnen. Beachten Sie, dass der Immuno-Antikörper in der Überstandfraktion fehlt und während der Peptidelution in der Pelletfraktion verbleibt. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man instabile MultiPro-Komplexe unter Verwendung des chemischen Vernetzers DSP sowie anschließender immunmagnetischer Affinitätsreinigung isoliert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Zelllösungen und Lysate gekühlt zu halten, um instabile Wechselwirkungen während der Vernetzung zu erhalten und die Proteaseaktivität zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.