Name: Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Lernen Sie die Isolierung labiler Multi-Protein-Komplexe durch kontrolliertes in vivo Cross-Linking mit DSP und immuno-magnetische Affinitätschromatographie. Diese Methode stabilisiert transiente Proteininteraktionen für die Analyse.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, um VF (NS42599 und GM077569) unterstützt.

1. Vorbereitungen für die Vernetzung <ol><li> Sie werden auf Platte müssen eine ausreichende Anzahl von Zellen zur Isolierung von 500 ug Protein pro Standard-Rohr-Reaktion zu ermöglichen. Eine einzelne Röhre ausreichend sein kann für die Identifizierung von putativen Interaktionspartner eines Proteins von Interesse durch Immunoblot. In diesem Fall Bead gebunden Material kann mit SDS-PAGE-Probenpuffer (Immunpräzipitation) eluiert werden. Für massenspektrometrischen Analyse sollte die Zahl der normalen Reaktionen mindestens zehn Mal erhöht werden und Protein-Komplexe sollten durch out-Wettbewerb mit einem Peptidantigen durch den Antikörper verwendet (Immunaffinitätschromatographie) anerkannt eluiert werden. Diese Strategie ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen frei von Immunglobulin. </li><li> Die optimale Zelldichte für die Vernetzung zwischen 75% und 90% Konfluenz. In hoher Konfluenz Bedingungen neigen Zellen, die auf jeder anderen Stapel, der nimmt die Zugänglichkeit der zellpermeablen Vernetzer, um alle Zellen. </li><li> Zelltyp und experimentellen Bedingungen sollte auf dem Boden der Zelle Platte markiert werden. Wir routinemäßig auch Kontrollen mit Vehikel. </li><li> Bereiten Sie alle Lösungen außer der DSP-Lösung vor der Vernetzung. <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat an Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit CaCl 2 0,1 mM und CaCl 2 1 mM (PBS / Ca / Mg) vor Beginn des Experiments. Die Zugabe von Kalzium-und Magnesium-Ionen ist entscheidend für die Adhäsion von Zellen an der Kultur Platte im Verlauf des Experiments. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> 50X Komplette Protease Inhibitor Cocktail - 1 Tablette in 1 ml Milli-Q Wasser gelöst. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> 20% Triton X-100 wiegt 10g Triton X -100 und verdünnt in einem Gesamtvolumen von 50 ml Milli-Q Wasser. Rock bei 4 ° C über Nacht und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Nicht länger als 1 Monat. Verwenden Verdünnungen von diesen 20% Aktien an die Lyse-und IP-Puffer unten beschrieben vorbereiten. </li><li> 50X DSP Quenching-Lösung 1M TRIS auf pH 7,4. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie eine 10-fach Puffer A-Lösung. 10X Puffer A: <ul><li> 50 mL 1 M HEPES </li><li> 150 mL 5 M NaCl </li><li> 10 mL 0,5 M EGTA </li><li> 250 ul 2 M MgCl 2 </li><li> Der pH-Wert auf 7,4 </li><li> Bringen Endvolumen von 500 mL </li></ul> Die 10X Buffer Eine Lösung ist es, 1X Puffer A nach Bedarf verdünnt. 1x Puffer A ist auch in Lysat und Immuno-magnetische-Fällung Puffer verwendet. Buffer A 1X <ul><li> 10 mM Hepes </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 0,1 mM MgCl 2 </li><li> pH-Wert 7,4 </li></ul></li><li> Lysis Buffer 1X Puffer A + 0,5% Triton X-100. </li><li> Immuno-magnetische Niederschlag Buffer (IP Buffer) 1X Puffer A + 0,1% Triton X-100. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Vernetzungslösung <ol><li> Bereiten Sie die DSP-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf Zellen. DSP ist stark hydrophob und sollte in DMSO vor der Verdünnung in PBS / Ca / Mg-Puffer gelöst werden. Lösen Sie 40 mg des DSP in 1 ml DMSO. Dies macht eine 100 mM Lösung von DSP (Das Molekulargewicht der DSP ist 404,42 g / mol). </li><li> Warm einem geeigneten Volumen PBS / Ca / Mg bis 37 ° C, um eine Verwässerung der DSP / DMSO in PBS zu erleichtern. Volumes für verschiedene Plattengrößen benötigt: 6-Well-Platte 2 mL pro Well 10 cm Platte 10 mL pro Platte 15 cm Platte 20 mL pro Platte </li><li> Add 10 &amp;mgr; l von DSP / DMSO-Stammlösung pro 1 ml warmes PBS / Ca / Mg. Add DSP / DMSO Stammlösung tropfenweise mit wiederholten Mischen, bis alle DSP gelöst hat. Machen Sie eine Control-Lösung von 10 ul DMSO hinzugefügt, um alle 1 ml PBS / Ca / Mg. </li><li> Legen Sie alle PBS / Ca / Mg-Lösungen in einem Eis-Wasser-Bad nicht länger als 10 min. </li></ol> 3. Bereiten Cells für Vernetzung <ol><li> Bereiten Sie ein Eiswasserbad, dass alle Platten der Vernetzung oder der Fahrzeugsteuerung Inkubation passen. </li><li> Nehmen Platten aus dem 37 ° C Inkubator und legen Sie sie sofort in das Eis-Wasser-Bad. </li><li> Wash-Zellen zweimal mit eiskaltem PBS / Ca / Mg. Verwenden Sie das gleiche Volumen, die Sie für den Vernetzer Inkubation verwenden (siehe Abschnitt 2.2). </li><li> Entfernen zweiten Wäsche und fügen entweder Fahrzeugsteuerung oder DSP Vernetzung Pufferlösung. </li><li> Inkubieren auf Eis für zwei Stunden. Sie sollten die Platten etwa alle 20 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Zellen, die durch Lösung bedeckt sind. Sie können vielleicht ein wenig DSP aus der Lösung ausfallen. Das ist normal. </li></ol> 4. Die Inaktivierung von DSP Reaction <ol><li> Bereiten Sie eine 1X DSP Abschrecken Lösung von 20 mM Tris pH 7,4 in PBS / Ca / Mg (20 ul 1 M Tris pH 7,4 je 1 ml PBS / Ca / Mg). </li><li> Entfernen Sie das Fahrzeug-Steuerung und Vernetzung Lösungen. </li><li> Add eiskalten Inaktivierung Lösung, Inkubation auf Eis für 15 Minuten. </li></ol> 5. Cell Lysis <ol><li> Während DSP Abschrecken Inkubation, bereiten Sie die Zell-Lyse-Puffer von 0,5% Triton X-100 in Puffer A mit Complete Protease Inhibitor Cocktail. Add 20 uL 50x Stammlösung von Komplett für alle 1 mL Lysepuffer. </li><li> Nach der 15 Minuten DSP Abschrecken Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS / Ca / Mg. </li><li> Add Lysepuffer + Komplett an Zellen und Fels bei 4 ° C für 30 Minuten. Einige schlugen vor, Volumen Lysepuffer für verschiedene Plattengrößen: <ul><li> 6-well-Platte 0,5 ml pro Vertiefung </li><li> 10 cm Platte 1 mL pro Platte </li><li> 15 cm Platte 1 mL pro Platte </li></ul></li><li> Nach der Lyse mit einem Zellschaber in die Zellen von der Platte zu sammeln. Achten Sie darauf, Lysate auf Eis zu halten, um Protease-Aktivität zu minimieren </li><li> Spin Zelllysate für 15 Minuten bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Mini-Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit (15.000 xg). </li><li> Pipette der Überstand in ein frisches Röhrchen. Verwerfen des Pellets. </li><li> Analysieren Protein-Ebene und fahren Sie mit Immunpräzipitation. </li></ol> 6. Vorbereitung Immuno-magnetische Beads Niederschlag Hinweis: Dieser Schritt ist in der Regel direkt nach Beginn der 2 Stunden Vernetzung Inkubation gestartet. <ol><li> Kombinieren Sie 30 ul Dynal immunomagnetische Kügelchen, 500 ul von IP Buffer (1x Puffer A + 0,1% Triton X-100) und der entsprechenden Menge an Antigen-spezifischen Antikörpern zu Mikrozentrifugenröhrchen Schraubverschluss. Bereiten Antikörper-freie und nicht-spezifischer Antikörper Rohre für negative Kontrollen. Die entsprechende Menge an Antikörper sollte basierend auf einzelne Antigene während separaten Experimenten bestimmt werden. Kennzeichnen Sie alle IP Röhren. </li><li> Lassen Sie die IP-Röhrchen in einem End-over-end Wippe bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubieren. Alternativ inkubieren Sie die IP-Rohre mit dem Antikörper über Nacht bei 4 ° Tag vor der Vernetzung. </li><li> Nach der Inkubation tun, eine schnelle 10 Sekunden Mini-Zentrifugation, um die Perlen am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Schieben Sie die Rohre in die magnetische Halterung, die die magnetischen Kügelchen ziehen wird vom Boden des Röhrchens. Mit den Perlen sicher aus der Art und Weise, können Sie nun ganz einfach wegwaschen alle ungebundenen Antikörper. </li><li> Verwenden Sie eine kleine Bohrung Aspirator Spitze wie eine Spitze für Gel oder p200 Spitze der Inkubationspuffer und alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Sobald die Inkubationsvolumen entfernt in 1 ml IP-Puffer hinzu. </li><li> Cap das Rohr vorsichtig resuspendieren die Perlen, und inkubieren alle IP-Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit end-over-end Rotation. </li><li> Wiederholen Sie den 5 Minuten Waschschritt (Schritte 6.3 bis 6.6) noch einmal mit einem frischen Milliliter IP Buffer. </li><li> Die IP-Röhren können in der letzten Waschung Inkubation bleiben, bis das vernetzte Lysat ist bereit, um die Perlen hinzugefügt werden. </li></ol> 7. Inkubieren Vernetzte Lysate mit Immuno-magnetische Beads <ol><li> Nach der letzten Waschung Spin Immuno-magnetische Kügelchen, die in einem Mini-Zentrifuge für 10 Sekunden. Dann fahren Sie mit den Rohren in die magnetische Halterung rutschen. </li><li> Auch mit einem kleinen Bohrung Absaugspitze, entfernen Sie die Inkubationszeit Volumen aus der Tube. Sofort im 500 mL aus vernetztem Zelllysat (vorausgesetzt Lysat bei 1 pg / mL), um die Röhrchen mit immuno-magnetischen Kügelchen. Wenn Sie verwenden möchten Peptid Wettbewerb als negative Kontrolle, sollte eine entsprechende Menge an Peptid an dieser Stelle aufgenommen werden. Frühere Experimente durchgeführt werden, um entsprechende Peptid Wettbewerbsbedingungen zu bestimmen. Alternativ können Sie Lysat freien Immuno-magnetische Kügelchen als negative Kontrolle haben. In diesem Fall sofort hinzufügen 500 ul der Lysate Buffer (1x Puffer A + 0,5% Triton X-100) + Komplette dem Immuno-magnetische Kügelchen. </li><li> Vorsichtig resuspendieren Perlen. Resuspendierten Beads bei 4 ° in einer End-over-end Rotation für 2 Stunden inkubiert werden. </li></ol> 8. Wash Unbound Lysate aus Perlen <ol><li> Sobald Lysat über ausreichende Inkubationszeit hatte, nicht einen schnellen 10 Sekunden Spin in ein Mini-Zentrifuge. Dann schieben Sie die Rohre in die Magnethalterung. Die magnetische Halterung sollte in einem Eisbad für den Rest des Experiments gehalten werden. </li><li> Mit einem kleinen Bohrung Aspirator Spitze, entfernen Sie alle ungebundenen Lysat. Unmittelbar nachdem alle ungebundenen Lysat entfernt 1 mL IP-Puffer. </li><li> Cap der Röhre und sanft resuspendieren Perlen. </li><li> Sobald die Kügelchen sind resuspendiert wiederholen Sie die Perle Pelletierung Schritt (8,1). </li><li> Wieder absaugen alle Inkubationsvolumen und sofort 1 ml IP-Puffer, dann verschließen Sie die Tube. </li><li> Vorsichtig resuspendieren die Perlen in IP Buffer. Inkubieren resuspendierten Beads für 5 Minuten bei 4 ° mit end-over-end zu schaukeln. </li><li> Wiederholen Sie die Perle Waschschritte (8,4 bis 8.6) 4 weitere Male. </li></ol> 9. Denaturieren Probe und Sammeln von Perlen <ol><li> Nach all der Immuno-magnetische Niederschlag Rohren gewaschen wurden, re-Sediment der Perlen (8,1), und schieben Sie Rohre in denMagnethalter. </li><li> Gebundene Proteine, die immuno-magnetische Kügelchen sind in denaturierenden Bedingungen entfernt. Absaugen der letzten IP Buffer waschen und entfernen Sie die IP-Rohr aus dem Magnethalter. </li><li> Add 1x Gel Sample Buffer, um die IP Rohr oberhalb des Wulstes Pellet zu bündeln die Perlen am unteren Rand der Röhre wieder. Die Höhe der Probenpuffer hängt auch Größe des Gels verwendet werden. Möglicherweise müssen Sie leicht auf den Boden der Röhre, um alle der Perlen in der Gel-Probenpuffer resuspendiert bekommen. </li><li> Wiederholen Sie die Denaturierung (9,2 bis 9,3) für jede IP-Rohr. </li><li> Immuno-magnetische Kügelchen in Gel-Probenpuffer resuspendiert werden dann bei 75 ° C für 5 Minuten, um die Denaturierung abzuschließen. </li><li> Sobald die Probe wurde denaturiert es auf einer SDS-PAGE-Gel kann für Western-Blot durchgeführt werden. Entleerte Immuno-Magnetic Beads kann erneut durch Zentrifugation pelletiert und aus der Probe mit dem Magnethalter. </li></ol> 10. Elution von vernetztem Komplexe mit antigenen Peptiden (Immunaffinitätschromatographie). <ol><li> Nach all der Immuno-magnetische Immunpräzipitation Rohre wurden gewaschen, re-Sediment der Perlen (8,1), und schieben Sie Rohre in den Magnethalter. Saugen Sie den Überstand und mit 10 ul Puffer A ergänzt mit dem antigenen Peptid, das durch den Antikörper für Immunisolation von Protein-Komplexen eingesetzt anerkannt. Sie sollten testen Konzentrationen im Bereich von 10 bis 200 pM für die effiziente Elution. </li><li> Inkubieren Sie die Perlen für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Legen Sie Perlen in der magnetischen stehen und sorgfältig wieder die 10 ml eluierte Material. Speichern Sie diese Überstand. </li><li> Schnell Waschen der Kügelchen mit Puffer A und entsorgen Sie die Wäsche. Speichern Sie die Perlen. </li><li> Add Gel Sample Buffer, um die gespeicherten Überstand und Perlen zu einer Konzentration von 1X. Inkubieren diese Rohre bei 75 ° C für 5 Minuten. </li><li> Analysieren Perlen-und Peptid-Eluat durch SDS-PAGE. Das Eluat sollte frei von IgG sowohl durch Protein-Färbung von SDS-PAGE oder Immunoblots (Abbildung 1B). Dieses Material frei von IgG ist für Massenspektrometrie. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Isolierung von AP-3 interagierende Protein-Komplexen und Membranproteine. HEK293-Zellen (A) oder PC12-Zellen (B) wurden entweder in Gegenwart Kontrolle über das Fahrzeug behandelt (DMSO, ungerade Gassen Abb. 1A) oder DSP (auch Bahnen Abb.. 1A oder alle Bahnen in Abb. 1B). Abb.; geklärt Extrakte wurden entweder mit Perlen allein (Abb. 1A, Lanes 3-4), Transferrin-Rezeptor-Antikörper (Abb. 1A, Lanes 5-6) oder AP-3 δ Antikörper (Abb. 1A, Lanes 7-10 inkubiert . 1B, Bahnen 1-10). Immunkomplexe mit SDS-PAGE-Probenpuffer (Abb. 1A) wurden eluiert, Buffer A allein oder (Abb. 1B, Bahnen 1-2), oder Puffer A mit steigenden Konzentrationen des δ antigene Peptid entsprechend den Aminosäuren 680 710 ergänzt der menschlichen δ-Adaptin (NCBI: AAD03777; gi: 1923266) (Abb. 1B, Bahnen 3-10). Dieses Peptid bindet die δ-Antikörper. Nach Peptid Elution wurden die Überstände (S) und Perlen (B) durch Immunoblot (Abb. 1B) analysiert. AP-3, die mit Antikörpern gegen die δ, β3 und σ3 Untereinheiten erkannt wird, Copräzipitate mit den folgenden lösliche Faktoren: Clathrin schwere Kette (CHC), die BLOC-1-Untereinheit pallidin und der HOPS-Komplex Untereinheit vps33b, sowie die Membranproteine ​​Phosphatidylinositol-4-Kinase-Typ-II-alpha (PI4KIIα) und der Zink-Transporter 3 (ZnT3). Beachten Sie das Fehlen von IgG-Maus schweren Ketten in das Peptid eluiert Überstand in Abb.. 1B.

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSP, eine Membran durchlässig, chemisch reduzierbaren Vernetzer mit einem Spacer-Arm von 12 Å wird verwendet, um transiente Protein-Interaktionen 1,2,3,4 stabilisieren. Hier haben wir diese Strategie mit dem Adapter-Komplex AP-3 ein lösliches Protein-Komplex, und erkennt möglichen Membranproteine ​​in Vesikeln aus Endosomen 5 veranschaulicht. AP-3 bindet selektiv an die Zink-Transporter ZnT3 und der Lipid-Kinase-Phosphatidylinositol-4-Kinase-Typ-II-alpha, aber nicht Transferrin-Rezeptor 1,4,6....

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>1 Tablette in 200 mL Wasser auflösen; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; auf eine Endkonzentration von 1 mM und CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; auf eine Endkonzentration von 0,1 mM hinzufügen</td></tr><tr><td>Dithiobis (Propionsäure-Succinimidylester) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>Feuchtigkeitsempfindlich, im luftdichten Behälter bei 4&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, Schaf anti-Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>Die Kugeln sind auch als Schaf anti-Kaninchen erhältlich</td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2-Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von labile multi-protein-komplexe durch in vivo kontrollierte cellular cross-linking und immuno-magnetische affinitätschromatographie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Die Dynamik der zellulären Maschinerie häufig auf vorübergehende und / oder schwache Protein-Assoziationen gebaut. Diese geringe Affinität Wechselwirkungen ausschließen strengen Methoden zur Isolierung und Identifizierung von Protein-Netzwerken um ein Protein von Interesse. Der Einsatz von chemischen Vernetzer erlaubt die selektive Stabilisierung der labilen Interaktionen, also unter Umgehung biochemischen Einschränkungen für die Reinigung. Hier präsentieren wir ein Protokoll zugänglich für Zellen in Kultur, dass ein homo Vernetzer verwendet mit einem Spacer-Arm von 12 Å, Dithiobis-(Succinimidyl proprionate) (DSP). DSP wird durch Reduktion einer Disulfidbrücke im Molekül gespalten. Die Vernetzung mit Immunaffinitätschromatographie der Proteine ​​von Interesse mit magnetischen Beads kombiniert ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen, die sonst nicht überstehen würden Reinigung. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western-Blot-Techniken, und es kann bis zur Proteinidentifizierung skaliert werden durch Massenspektrometrie 1. Stephanie A. Zlatic und Pearl V. Ryder trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Die Zelle durchlässig Vernetzer DSP [Dithiobis-(Succinimidylpropionat)] stabilisiert vorübergehend und labile Wechselwirkung<em&gt; In vivo</em&gt;, Die ihre Isolation ermöglicht mit strengen Protein-Komplex Reinigungstechniken. Hier präsentieren wir eine Technik zur Vernetzung von Zellen in Kultur gezüchtet, durch Isolation von Protein-Komplexe durch Immunpräzipitation gefolgt.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

Die dynamische Natur zellulärer Maschinerien basiert häufig auf transienten und/oder schwachen Proteinassoziationen. Diese Interaktionen mit niedriger Affinität schließen ...

Für die Vernetzung, gefolgt von Immunpräzipitation. Zellen mit einer Dichte von 80 bis 90 % werden mit einem millimolaren, eiskalten DSP in PBS, Calcium, Magnesium oder DMSO inkubiert.Vehicle-Kontrolle. DSP ist ein homo-bifunktioneller, membranpermeabler und reduzierbarer Vernetzer, der freie Aminogruppen miteinander verbindet, die weniger als 12 Ångström voneinander entfernt sind. Nach der Vernetzung werden die Zellen lysiert und Immunpräzipitationen unter Verwendung von Standardkontrollen durchgeführt.Protein-Komplexe werden anschließend durch reduzierendes SDS-PAGE aufgetrennt, wobei reduzierende Agentien DSP spalten, sodass die Identifizierung einzelner Proteine durch Immunblotting ermöglicht wird. Hallo, ich bin Stephanie Ick aus dem Labor von Dr. Victor Fonde aus der Abteilung für Zellbiologie an der Emory University. Und ich bin Pearl Ryder, ebenfalls aus dem Fonde-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Myprotein-Komplexen unter Verwendung kontrollierter Vernetzung, gefolgt von immunmagnetischer Affinitätschromatographie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um vorübergehende, labile Proteinwechselwirkungen zu untersuchen. Beginnen wir also.Beschriften Sie zunächst den Boden der Zellkulturplatten, um den Zelltyp und die spezifische experimentelle Bedingung anzugeben. Ein positives Symbol hier zeigt DSP-behandelte Proben an, einschließlich einer negativen Kontrolle mit nur DMSO als Fahrzeugkontrolle. Geben Sie Medium zu den Platten hinzu, um sie für das Ansäen der Zellen vorzubereiten.HEK-Zellen, die im Verdünnungsverhältnis 1:5 ausgesät wurden, um die Isolierung von 500 Mikrogramm Protein pro Standardröhrchen-Reaktion zu ermöglichen. Ein einzelnes Röhrchen kann ausreichen, um die vermuteten Bindungspartner eines Proteins von Interesse durch Immunoblot aus der Massenspektrometrie-Analyse zu identifizieren. Erhöhen Sie die Anzahl der Standardreaktionen um mindestens das 10-Fache.Bereiten Sie außerdem Stamm­lösungen der meisten in dem Vernetzungs­experiment verwendeten Lösungen vor. Dazu gehört PBS, der mit 0,1 Millimolar Calciumchlorid und einem Millimolar Magnesiumchlorid ergänzt ist und als PBS-Calcium-Magnesium bezeichnet wird. Die Zugabe von Calcium- und Magnesiumionen ist entscheidend für die Adhäsion der Zellen an die Kulturplatte. Während des Experiments die Lösung bei vier Grad Celsius lagern. Weitere Bestände umfassen die Quenching-Lösung für den Vernetzer, 50 X komplettes Proteaseinhibitorcocktail, das alle 20 Minuten verwirbelt wird, bis das Pellet gelöst ist. 20 % Triton X 100, das bei vier Grad Celsius gelagert wird und innerhalb eines Monats verwendet werden sollte, sowie 10 X und 1 X Puffer A-Lösungen.Bereiten Sie alle Lösungen gemäß des beigefügten schriftlichen Protokolls vor und lagern Sie diese entsprechend. Bereiten Sie abschließend den Lysepuffer, bestehend aus 1x Puffer A, mit 0,5 % TRITTON X-100 und den immunmagnetischen Präzipitationspuffer oder IP-Puffer, bestehend aus 1x Puffer, vor.Fügen Sie 0,1 % TRITON X-101 hinzu. Zwei Tage nach der Aussaat weisen die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % auf, was optimal für die Vernetzung ist. Unter Bedingungen hoher Konfluenz neigen die Zellen dazu, sich übereinander zu lagern, wodurch die Zugänglichkeit des zellpermeablen Vernetzers für alle Zellen abnimmt. Stellen Sie die Platten zurück in den Inkubator, bis sie zur Vernetzung bereit sind.Bereiten Sie die DSP-Vernetzerlösung unmittelbar vor der Anwendung auf die Zellen frisch zu. Da DSP stark hydrophob ist, wird es zunächst in DMSO auf eine Konzentration von 100 Millimolar gelöst, bevor es in den PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium verdünnt wird. Um die Verdünnung von DSP in den PBS-Puffer mit Calcium und Magnesium weiter zu verbessern, erwärmen Sie ein geeignetes Volumen und geben Sie 10 Mikroliter der DSP- und DMSO-Stammlösung hinzu.Fügen Sie pro Milliliter warmes PBS mit Calcium und Magnesium die D-S-P-D-M-S-O-Stammlösung tropfenweise unter wiederholtem Mischen hinzu, bis sich das DSP vollständig aufgelöst hat. Bereiten Sie außerdem eine Fahrzeugkontrolllösung mit 10 Mikrolitern DMSO pro Milliliter PBS mit Calcium und Magnesium vor. Nach der Verdünnung des DSP bewahren Sie alle PBS-Lösungen mit Calcium und Magnesium nicht länger als 10 Minuten in einem Eiswasserbad auf.Bereiten Sie als Nächstes ein Eiswasserbad vor, das alle in dem Experiment verwendeten Platten aufnehmen kann. Entnehmen Sie die Kulturplatten mit den Zellen aus dem 37-Grad-Celsius-Inkubator und stellen Sie sie unverzüglich in das Eiswasserbad. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskalter PBS, die Calcium und Magnesium enthält, unter Verwendung der zuvor für die Inkubation mit dem Vernetzer vorbereiteten Volumina; für eine 6-Well-Platte berechnen Sie zwei Milliliter pro Vertiefung und so weiter.Nach der zweiten Wäsche. Geben Sie entweder die Fahrzeugkontrolle, also DMSO in Puffer gelöst, oder die DSP-Vernetzungspufferlösung zu den Zellen hinzu, inkubieren Sie zwei Stunden auf Eis und überprüfen Sie etwa alle 20 Minuten, ob alle Zellen von der Lösung bedeckt sind. Falls einige Zellen freiliegen, kippen und drehen Sie die Petrischale, um sie erneut gleichmäßig zu bedecken. Es ist normal, dass eine geringe Menge DSP ausfällt.Während der zweistündigen Inkubation mit den Zellen, bevor die zweistündige Inkubation endet, bereiten Sie eine 1-X-DSP-Quench-Lösung vor, indem Sie den Stamm in PBS mit Calcium und Magnesium verdünnen. Bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis auf, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, indem Sie den nicht reagierten DSP inaktivieren. Wenn die zwei Stunden abgelaufen sind, entfernen Sie die Fahrzeugkontrolle und die Vernetzungslösungen von den Zellen.Geben Sie die eiskalte DSP-Abschrecklösung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit verdünnen Sie das vollständige Proteaseinhibitor-Cocktail-Stammgemisch im Verhältnis 1 zu 50 in den Zelllysepuffer. Sobald die 15 Minuten abgelaufen sind, waschen Sie die Zellen zwei Mal mit PBS mit Calcium und Magnesium.Anschießend den Lysepuffer mit den Proteaseinhibitoren zu den Zellen geben und 30 Minuten bei vier Grad Celsius schwenken. Nach 30-minütiger Zelllyse die Zellen mit einem Zellabstreifer von der Platte sammeln. Dabei sicherstellen, dass die Lysate auf Eis gehalten werden, um die Proteaseaktivität zu minimieren.Zentrifugieren Sie die Zelllysate 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischminizentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit von 15.000 G. Pipettieren Sie das Überstand in ein frisches Gefäß und entsorgen Sie den Pellet. Analysieren Sie die Proteinkonzentrationen mithilfe des Bradford-Assays und führen Sie danach die Immunpräzipitation durch. Beginnen Sie unmittelbar nach Starten der zweistündigen Vernetzungsreaktion in Schraubtopf-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Vorbereitungen für die Immunpräzipitation.Mischen Sie 30 Mikroliter anti-IgG-Immunomagnetbeads mit 500 Mikrolitern IP-Puffer. Geben Sie den Antikörper gegen das Zielantigen hinzu. Die geeignete Menge des Antikörpers sollte für jedes einzelne Antigen bestimmt werden.In vorläufigen Experimenten umfassen mögliche negative Kontrollen für die Kügelchen: kein Antikörper, Kügelchen allein und Isotyp-Kontrollantikörper-Kügelchen, um den IP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen zu binden. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem End-over-End-Rocker. Am Ende der Inkubation kurz zentrifugieren und die Röhrchen in den Magnetständer schieben. Die Kügelchen sammeln sich an der Seite des Magneten.Entfernen Sie die Lösung, die ungebundene Antikörper enthält, und waschen Sie die Perlen sofort, um zu verhindern, dass sie austrocknen. Nach zwei Waschschritten geben Sie 500 Mikroliter einer Lösung mit einem Mikrogramm pro Milliliter DSP-negativem oder DSP-positivem Zelllysat zu den entsprechenden Röhrchen hinzu. Ein Peptid-Wettbewerbs-Negativkontrolle kann in diesem Schritt vorbereitet werden, indem das immunogene Peptid in einer in Vorversuchen bestimmten Konzentration zur Lysat-Perlen-Mischung gegeben wird.Eine weitere mögliche negative Kontrolle, die in diesem Schritt vorbereitet werden kann, ist eine Reaktion ohne Lysat, die durch Zugabe von nur 500 Mikrolitern Lysepuffer zu den Kügelchen hergestellt wird. Resuspendieren Sie die Kügelchen für die experimentellen und Kontrollreaktionen vorsichtig. Vortexen Sie nicht, da dies zum Zerbrechen der Kügelchen führen kann; inkubieren Sie stattdessen bei vier Grad mit end-over-end-Rotation für zwei Stunden.Nach zwei Stunden das Lysat mithilfe des Magnetständer entfernen. Die Kügelchen kurz zentrifugieren und insgesamt sechs Mal mit einem Milliliter IP-Puffer waschen. Jede Waschung fünf Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.Um die gebundenen Komplexe zu lösen, geben Sie einen x-Gel-Probenpuffer in das IP-Röhrchen direkt über dem Perlenpellet hinzu. Um die Perlen am Boden des Röhrchens zu sammeln, klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens, damit alle Perlen im Gel-Probenpuffer resuspendiert werden. Alternativ zur Immunaffinitätsisolierung werden 30 Mikroliter Puffer zugegeben, der mit dem immunogenen Peptid zu den Perlen ergänzt wurde.Die erforderliche Konzentration des immunogenen Peptids wird empirisch bestimmt. Nachdem ein Bereich von 10 bis 200 Mikromolar getestet wurde, die Kügelchen zwei Stunden bei vier Grad inkubieren, die Röhrchen alle 30 Minuten vorsichtig schütteln. Den magnetischen Halter verwenden, um die 30 Mikroliter, die die eluierten Komplexe enthalten, abzutrennen, und in einem sauberen Röhrchen aufbewahren; die Kügelchen mit IP-Puffer waschen und aufbewahren.Geben Sie einen x-Gel-Probenpuffer zu den Kügelchen für beide Elutionsmethoden hinzu. Erhitzen Sie die immungemagnetischen Kügelchen, die in Gel-Probenpuffer resuspendiert wurden, zusätzlich zur Denaturierung der Proteine bei 75 Grad Celsius für fünf Minuten. Dieser Schritt spaltet auch das DSP-Molekül, wodurch die einzelnen Proteine im Komplexlauf aufgetrennt werden können.Die Proben auf einem SDS-Page-Gel für die Western-Blot-Analyse. Die entleerten immunmagnetischen Kügelchen können durch Zentrifugation abgetrennt und mithilfe eines Magnethalters vor dem Beladen aus der Probe entfernt werden. Wenn der immunaffine EUA sowohl durch Protein-Färbung mittels SDS-Page als auch durch Immunblots frei von IgG ist, eignet er sich für die Massenspektrometrie.Hier ist ein Beispiel für eine Westernblot-Analyse von Material aus vernetzten und nicht vernetzten Zelllysaten, gefolgt von einer immunmagnetischen Präzipitation unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die AP-drei-Untereinheit. Die Delta-Vernetzung ermöglicht den Nachweis von wechselwirkenden Proteinen, die bei nicht vernetzten Proben während immunmagnetischer Isolierungen nicht sichtbar sind. Negative Kontrollen zeigten keinen spezifischen Proteinnachweis unter Verwendung einer antikörperfreien und einer isotypgepaßten Kontrolle mit einem IgG, das gegen den Transferrinrezeptor gerichtet ist, sowohl für nicht vernetzte als auch für vernetzte Proben.In diesem Beispiel wurde eine Affinitätspeptidelution verwendet, um die an den IP-Antikörper gebundenen Proteine zurückzugewinnen. Beachten Sie, dass der Immuno-Antikörper in der Überstandfraktion fehlt und während der Peptidelution in der Pelletfraktion verbleibt. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man instabile MultiPro-Komplexe unter Verwendung des chemischen Vernetzers DSP sowie anschließender immunomagnetischer Affinitätsreinigung isoliert.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Zelllösungen und Lysate gekühlt zu halten, um instabile Wechselwirkungen während der Vernetzung zu erhalten und die Proteaseaktivität zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie (Video) | JoVE Journal

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