Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

Für die Vernetzung, gefolgt von der Immunpräzipitation. Eingriffszellen mit einer Dichte von 80 bis 90 % werden mit einem Millimolar eiskalt inkubiert. DSP nur in PBS, Calcium, Magnesium oder DMSO.

Steuerung des Fahrzeugs. DSP ist ein homo-bifunktionaler membranpermeabler und der reduzierbare Vernetzer, der frei vernetzt und das heißt innerhalb von 12 Angström voneinander. Anschließend werden die vernetzenden Zellen lysiert und Immunpräzipitationen mit Hilfe von Standardkontrollen durchgeführt.

Proteinkomplexe werden dann aufgelöst, indem die SDS-Seite reduziert wird, wodurch das gespaltene DSP der Wirkstoffe reduziert wird, was die Identifizierung einzelner Proteine durch Immunblot ermöglicht. Hallo, ich bin Stephanie Ick aus dem Labor von Dr.Victor Fonde in der Abteilung für Zellbiologie an der Emory University. Und ich bin Pearl Ryder, ebenfalls aus dem Fonde-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Myprotein-Komplexen mittels kontrollierter Vernetzung mit anschließender immunomagnetischer Affinitätschromatographie. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um transiente labile Proteininteraktionen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie damit, die Unterseite der Zellplatten zu beschriften, um den Zelltyp und die spezifischen Versuchsbedingungen anzugeben. Ein positives Symbol zeigt hier an, dass DSP behandelt wurde und nur eine Fahrzeugsteuerung mit negativem DMSO enthält. Geben Sie Medien zu den Platten, um sie für die Zellaussaatplatte vorzubereiten.

HEK-Zellen wurden in einer Verdünnung von eins bis fünf ausgesät, um die Isolierung von 500 Mikrogramm Protein pro Standardröhrchenreaktion zu ermöglichen. Ein einzelnes Röhrchen kann ausreichen, um die mutmaßlichen Bindungspartner eines Proteins von Interesse durch Immunblot aus der Massenspektrometrieanalyse zu identifizieren. Erhöhen Sie die Anzahl der Standardreaktionen mindestens um das 10-fache.

Bereiten Sie auch Stängel der meisten Lösungen vor, die im Vernetzungsexperiment verwendet wurden. Dazu gehören PBS, das mit 0,1 Millimolar Calciumchlorid ergänzt wird, und ein Millimolar Magnesiumchlorid, das als PBS Calciummagnesium bezeichnet wird. Die Zugabe von Calcium- und Magnesiumionen ist entscheidend für die Adhäsion der Zellen an der Kulturplatte.

Lagern Sie die Lösung während des Experiments bei vier Grad Celsius. Zu den weiteren Vorräten gehört der Vernetzer-Quenching Solution 50 X Complete Protease Inhibitor Cocktail, der alle 20 Minuten vortext, bis das Pellet aufgelöst ist. 20% Tritan X 100, das bei vier Grad Celsius gelagert wird und innerhalb eines Monats verwendet werden sollte und 10 x und ein x Puffer eine Lösung.

Bereiten Sie alle Lösungen vor und bewahren Sie sie auf, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie abschließend den Lysepuffer vor, der aus einem X-Puffer besteht. Ein Plus von 0,5 % TRITTON X 100 und ein immunomagnetischer Fällungspuffer oder IP-Puffer, der aus einem X-Puffer besteht.

A plus 0,1 %TRITTON X 101 bis zwei Tage nach der Beschichtung weisen die Zellen eine Fluenz von 80 bis 90 % co auf, was optimal für die Vernetzung ist. Unter Bedingungen mit hoher Kofluenz neigen die Zellen dazu, sich übereinander zu stapeln, was zu einer Verringerung der Zugänglichkeit des zelldurchlässigen Vernetzers zu allen Zellen führt. Legen Sie die Platten zurück in den Inkubator, bis sie zum Vernetzen bereit sind.

Bereiten Sie die DSP-Vernetzerlösung unmittelbar vor dem Auftragen auf die Zellen vor. DSP ist stark hydrophob und wird daher in DMSO bis zu einer Konzentration von 100 Millimolar gelöst, bevor es in den PBS-Calcium-Magnesium-Puffer verdünnt wird. Um die Verdünnung von DSP in den PBS-Calcium-Magnesium-Puffer weiter zu verbessern, erwärmen Sie das Volumen und fügen Sie 10 Mikroliter der DSP- und DMSO-Stammlösung hinzu.

Für jeden Milliliter warmes PBS-Calcium-Magnesium die D-S-P-D-M-S-O-Stammlösung tropfenweise unter wiederholtem Mischen hinzufügen, bis sich das gesamte DSP aufgelöst hat. Bereiten Sie außerdem eine Fahrzeugsteuerungslösung von 10 Mikrolitern DMSO für jeden Milliliter PBS-Calcium-Magnesium vor. Bewahren Sie nach dem Verdünnen des DSP alle PBS-Calcium-Magnesium-Lösungen nicht länger als 10 Minuten in einem Eiswasserbad auf.

Bereiten Sie als Nächstes ein Eiswasserbad vor, in dem alle im Experiment verwendeten Platten aufbewahrt werden. Nehmen Sie die Kulturplatten mit den Zellen aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und legen Sie sie sofort in das Eiswasserbad. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS-Calcium-Magnesium, wobei Sie die gleichen Volumina verwenden, die zuvor für die Inkubation mit dem Vernetzer vorbereitet wurden, rechnen Sie mit zwei Millilitern pro Vertiefung und so weiter.

Nach der zweiten Wäsche. Geben Sie entweder die Vehikelsteuerung, d. h. das in Puffer gelöste DMSO oder die DSP-Vernetzungspufferlösung, zu den Zellen, inkubieren Sie zwei Stunden lang auf Eis und überprüfen Sie etwa alle 20 Minuten, ob alle Zellen mit der Lösung bedeckt sind. Wenn einige Zellen freiliegen, kippen und drehen Sie die Schale, um sie wieder gleichmäßig zu bedecken, es ist normal, dass eine kleine Menge DSP ausfällt.

Während der zweistündigen Inkubation mit den Zellen vor Beendigung der zweistündigen Inkubation wird eine 1-XDSP-Abschrecklösung hergestellt, indem der Stiel in PBS-Calcium-Magnesium verdünnt wird. Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, indem Sie den DSP deaktivieren, der nicht reagiert hat. Wenn die zwei Stunden abgelaufen sind, entfernen Sie die Fahrzeugsteuerungs- und Vernetzungslösungen aus den Zellen.

Die eiskalte DSP-Löschlösung zugeben und 15 Minuten auf Eis inkubieren. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die gesamte Proteasehemmer-Cocktailbrühe von eins zu 50 in den Zelllysepuffer. Sobald die 15 Minuten abgelaufen sind, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS Calcium Magnesium.

Geben Sie dann den Lysepuffer mit den Proteaseinhibitoren in die Zellen und rocken Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie nach 30 Minuten Zelllyse einen Zellschaber, um die Zellen von der Platte zu sammeln. Achten Sie darauf, die Lysate auf Eis zu halten, um die Proteaseaktivität zu minimieren.

Schleudern Sie die Zelllysate 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Tisch-Minizentrifuge bei einer Höchstgeschwindigkeit von 15.000 Gs.Pipettieren Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Analysieren Sie die Proteinspiegel mit dem Bradford-Assay und fahren Sie mit der Immunpräzipitation fort. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Immunpräzipitation unmittelbar nach Beginn der zweistündigen Vernetzungsreaktion in Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss.

Kombinieren Sie 30 Mikroliter immunmagnetische Anti-IgG-Kügelchen mit 500 Mikrolitern IP-Puffer. Fügen Sie den Antikörper gegen das gewünschte Ziel hinzu. Für jedes einzelne Antigen sollte die geeignete Antikörpermenge bestimmt werden.

In vorläufigen Experimenten beinhalten mögliche Negativkontrollen für die Kügelchen keine Antikörper, Kügelchen und Isotyp-Kontroll-Antikörperkügelchen, um den IP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen zu binden. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Endwippe Am Ende der Inkubation drehen Sie die Röhrchen schnell und schieben sie in die Magnethalterung. Die Kügelchen konzentrieren sich an der Seite des Magneten.

Entfernen Sie die Lösung, die ungebundene Antikörper enthält, und waschen Sie die Kügelchen sofort, um ein Austrocknen zu verhindern. Geben Sie nach zwei Wäschen 500 Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter DSP-negatives oder DSP-positives Zelllysat in die entsprechenden Röhrchen. Eine Negativkontrolle der Peptidkonkurrenz kann in diesem Stadium hergestellt werden, indem das immunogene Peptid in einer in Vorversuchen bestimmten Konzentration zu der Lysatbead-Mischung hinzugefügt wird.

Eine weitere mögliche Negativkontrolle, die in diesem Stadium hergestellt wird, ist eine reine Puffer- oder lysatfreie Reaktion, die durch Zugabe von 500 Mikrolitern Lysepuffer nur zu den Kügelchen hergestellt wird. Suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig für die Versuchs- und Kontrollreaktionen. Nicht wirbeln, da dies dazu führt, dass die Kügelchen brechen, bei vier Grad inkubiert und zwei Stunden lang von Ende zu Ende gedreht werden.

Entfernen Sie das Lysat nach zwei Stunden mit dem Magnethalter. Schleudern und waschen Sie die Kügelchen insgesamt sechs Mal lang mit einem Milliliter IP-Puffer. Inkubieren Sie jede Wäsche fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Um den gebundenen Komplexen zu entgehen, geben Sie einen x Gel-Probenpuffer in das IP-Röhrchen direkt über dem Bead-Pellet. Um die Kügelchen am Boden des Röhrchens zu bündeln, klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens, um alle Kügelchen im Gelprobenpuffer wieder aufzuwirbeln. Alternativ kann zur Immunaffinitätsisolierung bei 30 Mikrolitern Puffer mit dem immunogenen Peptid zu den Kügelchen supplementiert werden.

Die erforderliche Konzentration des immunogenen Peptids wird empirisch bestimmt. Nachdem Sie einen Bereich von 10 bis 200 Mikromolaren getestet haben, inkubieren Sie die Kügelchen zwei Stunden lang bei vier Grad und klopfen Sie alle 30 Minuten auf die Röhrchen. Verwenden Sie den Magnethalter, um die 30 Mikroliter mit den entgangenen Komplexen zu entfernen, und bewahren Sie sie in einer sauberen Tubenwäsche mit IP-Puffer auf und bewahren Sie die Kügelchen auf.

Geben Sie für beide Elutionsmethoden einen x Gel-Probenpuffer zu den Beads. Erhitzen Sie die in Gel-Probenpuffer suspendierten immunmagnetischen Kügelchen fünf Minuten lang bei 75 Grad Celsius und denaturieren Sie die Proteine. In diesem Schritt wird auch das DSP-Molekül gespalten, was die Auflösung der einzelnen Proteine im komplexen Lauf ermöglicht.

Die Proben auf einem SDS-Seitengel für Western Blotting. Die entleerten immunomagnetischen Kügelchen können durch Zentrifugation abgestoßen und vor dem Beladen mit einem Magnethalter aus der Probe entfernt werden. Wenn die Immunaffinitäts-EUA sowohl durch Proteinfärbung der SDS-Seite als auch durch Immunblots frei von IgG ist, ist sie für die Massenspektrometrie geeignet.

Hier ist ein Beispiel für einen Western Blot von Material aus vernetztem und unvernetztem Zelllysat, gefolgt von einer immunomagnetischen Fällung unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen die drei Untereinheiten AP. Die Delta-Vernetzung ermöglicht den Nachweis von interagierenden Proteinen, die in nicht vernetzten Proben während der immunomagnetischen Isolierung nicht zu finden sind. Negative Kontrollen zeigten keinen spezifischen Protein-Pulldown-Down mit antikörperfreien und Antikörper-Isotyp-angepassten Kontrollen unter Verwendung eines IgG, das gegen den Transferrinrezeptor gerichtet war, sowohl für unvernetzte als auch für vernetzte Proben.

In diesem Beispiel wurde die Affinitätspeptid-Elution verwendet, um die an den IP-Antikörper gebundenen Proteine zurückzugewinnen. Beachten Sie, dass der Immunantikörper in der Supernat-Fraktion fehlt und während der Peptid-Elution in der Schlagfraktion verbleibt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie labile MultiPro-Komplexe mit dem chemischen Vernetzer DSP isolieren können, gefolgt von einer immunmagnetischen Affinitätsreinigung.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Zelllösungen und Lysate gekühlt zu halten, um labile Wechselwirkungen während der Vernetzung aufrechtzuerhalten und die Proteaseaktivität zu minimieren. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.