Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

In diesem Video wird ein bildbasiertes High-Content-Screening durchgeführt, um die auf kleinen Molekülen basierende Modulation des Fibroblasten-Wachstumsfaktors Rasm Map Kinase-Signalweg zu bewerten: In Zebrafischembryonen werden transgene männliche und weibliche Wildtyp-Zebrafische in einem Zuchtkäfig verpaart. Befruchtete Eizellen fallen am Boden und werden gesammelt und in eine Petrischale gegeben. Die Embryonen werden über Nacht inkubiert und dann in einzelne Vertiefungen mit einer runden Bodenplatte von 96 Vertiefungen gelegt.

Das niedermolekulare BCI wird hinzugefügt, um die FGF-Signalgebung zu hyperaktivieren, und die Platte wird sechs Stunden lang inkubiert. Die Bilder von jedem Wurf werden mit einem konfokalen Platten-Reader aufgenommen und mit einem selbst entwickelten Algorithmus analysiert, der die Fluoreszenzintensitäten in bestimmten embryonalen Strukturen meldet. Hallo, ich bin Hiba Kado aus dem Labor von Dr. Michael Chang am Department of Microbiology and Molecular Genetics an der University of Pittsburgh.

Hallo, ich bin Andrea Spock vom Drug Discovery Institute der University of Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Zucht, Auswahl und Anordnung von Zebrafischembryonen für die chemische Behandlung. In einer 96-Well-Platte werden wir transgene Embryonen verwenden, die über die Aktivitäten von Glasfaser-Wachstumsfaktoren berichten und mit einem Molekül behandelt wurden, das dieses vergangene Weiß hyperaktiviert.

Wir zeigen Ihnen, wie wir High-Content-Screening-Methoden verwenden, um die Aktivität von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren in transgenen Zebrafischembryonen automatisch zu erfassen, zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Verfahren wird die Plattformtechnologie zur Nutzung von transgenen Zebrafischen und chemischen Hochdurchsatzsieben hervorheben. Also lasst uns loslegen.

Zwei Tage vor der Behandlung werden homozygote männliche transgene Zebrafische identifiziert und in einzelne Paarungsbecken gesetzt. Bringen Sie Trenner in die Tanks ein, fügen Sie dann jedem Aquarium einen Wildtyp-Weibchen hinzu und lassen Sie die Fische über Nacht bei 28 Grad Celsius in den Paarungskäfigen. Entfernen Sie am nächsten Morgen den Separator Nach einer Stunde bringen Sie den Fisch in ein neues Aquarium und gießen Sie die Embryonen in ein Plastiksieb.

Die Embryonen werden in 100-Millimeter-Schalen mit E 3-Lösung überführt und sechs bis acht Stunden lang bei 28 Grad Celsius inkubiert. Untersuchen Sie nach der Inkubation die Embryonen unter einem Stereomikroskop. Embryonen, die für Experimente geeignet sind, werden vergast.

Entferne zu diesem Zeitpunkt alle unbefruchteten Embryonen, die im Einzelzellstadium verbleiben. Entfernen Sie auch nicht lebensfähige Embryonen, die undurchsichtig oder missgebildet erscheinen. Dann frische E drei Lösung zugeben und über Nacht bei 28 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag legen Sie die Embryonen unter ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um die transgenen Embryonen für ein ähnliches und einheitliches Stadium zu sortieren. GFP-Expression 24 HPF-Embryonen zeigen eine sichtbare mittlere Hinterhirngrenze mit intensiver GFP-Expression und gut geformten Augen mit GFP-positiver dorsaler Netzhaut. Diese Embryonen sind aktiv und bewegen und wackeln in ihrem Korion mit einer Weidepipette aus Kunststoff.

Übertragen Sie die 24 HPF-Embryonen nacheinander in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Entfernen Sie mit einer Mikropipette überschüssige E drei Lösung aus den Vertiefungen. Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter E drei Lösung in jede Vertiefung

Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter DMSO zu allen Vertiefungen in den Spalten eins und 12 hinzu. Fügen Sie dann zwei Mikroliter BCL hinzu, die wie folgt in DMSO hergestellt wurden, einen Mikromolar in die Spalten zwei und sieben. Fünf Mikromolare bis drei und acht, 10 Mikromolare bis vier und neun 20.

Mikromolar bis zu den Spalten fünf und 10. Und schließlich 25 Mikromolare zu Spalte sechs und 11. Nun deckst du die Platte mit Alufolie ab und inkubierst sie sechs Stunden lang bei 28 Grad Celsius.

Geben Sie 10 Mikroliter Trica in jede Vertiefung, um die 30 HPF-Embryonen zu betäuben. Laden Sie dann die Platte in die ultraoffene Meta-Express-Software Molecular Devices Image Express. Wählen Sie eine Konfiguration mit einem Forex-Objektiv und einem maximalen Lochdurchmesser

Konfigurieren Sie den Laser-Autofokus so, dass er die Plattenunterseite erkennt und einen vorgegebenen optimalen Z-Versatz verwendet. Um die interessierenden Bereiche zu erkennen, legen Sie den Scanbereich auf eine einzelne Stelle von 2000 x 2000 Pixeln ohne Benning fest. Wählen Sie den passenden Plattentyp und den 488-Nanometer-Argonlaser bei einer Anregung über Emissionswellenlängen von 488 über 525 Nanometern.

Wählen Sie dann eine Vertiefung aus, die einen mit dem Vehikel behandelten Embryo enthält, und klicken Sie auf Probe suchen. Das Gerät führt einen Autofokus-Scan durch und nimmt ein einzelnes Bild auf, um die korrekte Bildaufnahme zu bestätigen. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip ein gut behandeltes Fahrzeug aus und nehmen Sie ein Bild auf.

Wenn das Bild scharf ist und den GFP-Ausdruck im Kopf zeigt. Positionieren Sie den Cursor über den hellsten Bereichen und stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzintensität im Bereich der 16-Bit-Kamera liegt. Weniger als 65.000 Einheiten.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einer anderen Fahrzeugsteuerung und einigen mit Verbindungen behandelten Vertiefungen. Passen Sie bei Bedarf die Laserleistung und -verstärkung so an, dass die hellsten Bereiche in den Positivkontrollbildern nicht gesättigt werden. Wählen Sie anschließend im Fenster zur Plattenerfassung und -steuerung die Option Platte erfassen, um den Plattenscan zu starten.

Das Gerät erfasst automatisch ein Bild pro Vertiefung für die gesamte Mikroplatte und archiviert sie in einer SQL Server-Datenbank. Sobald der Scan abgeschlossen ist, laden Sie die Bilder in die D-Definitionen hoch. Developer, indem Sie Developer mit aktivierter Slinger-Option öffnen.

Erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Wählen Sie dann im Dateimenü die Option Benutzerdefinierter Import aus. Navigieren Sie als Nächstes zu dem Ordner mit den Bildern und öffnen Sie eine Beispieldatei.

Wählen Sie einen Importfilter, der das Bildformat und die Dateistruktur erkennt, die von der Image Express Ultra-Plattform von molecular devices generiert wurden. Um nun die Bilder zu verarbeiten, öffnen Sie ein Kontrollbild und laden Sie die gewünschte Kognitionsnetzwerktechnologie oder den CNT-Algorithmus oder Regelsatz. Der hier verwendete benutzerdefinierte Algorithmus ist so konzipiert, dass er Embryo, Dotter und Kopf automatisch identifiziert und die Helligkeit und Fläche der GFP-exprimierenden Kopfstrukturen quantifiziert und den Regelsatz bis zum Stadium der Kopf- und Dottererkennung ausführt.

Um die korrekte Zuordnung von Dottersack und -kopf sicherzustellen, ändern Sie den Regelsatz, um den Schwellenwert für den Dotternachweis anzupassen, wenn das Dotter zu groß oder zu klein ist. Führen Sie als Nächstes den Regelsatz bis zur Erkennung von hellen Kopfstrukturen aus. Um die korrekte Zuweisung von GFP-exprimierenden Bereichen im Kopf sicherzustellen, ändern Sie den Regelsatz so, dass der Schwellenwert für die Erkennung von Kopfstrukturen als Vielfaches der geringen Intensität angepasst wird, bis die Erkennung heller Kopfstrukturen mit der visuellen Beobachtung übereinstimmt.

Führen Sie als Nächstes den gesamten Regelsatz manuell auf mehrere zufällig ausgewählte Bilder aus, die von vehikelbehandelten Embryonen und Positivkontrollbildern von PCI-behandelten Embryonen generiert wurden. Um den Algorithmus für alle Plattenbilder auszuführen, wählen Sie die zu analysierenden Platten aus und wählen Sie aus. Analysieren Sie, navigieren Sie dann zum optimierten Regelsatz und analysieren Sie alle Wells.

Mit dem integrierten Job-Scheduler werden leere Wells oder mehrdeutige Bilder während des Scans automatisch von der Analyse ausgeschlossen. Eine ständig aktualisierte Festungskarte wird angezeigt. Sowohl die Daten als auch die Bilder sind während des Laufs für die visuelle Inspektion zugänglich.

Die numerischen Daten und verarbeiteten Bilder werden automatisch gespeichert. Nachdem alle Bilder analysiert wurden, können die Daten in Software von Drittanbietern wie Excel, GraphPad oder Prism exportiert werden. Diese Abbildung zeigt archivierte Scanbilder von einem gut behandelten Fahrzeug und einem gut behandelten A BCI mit und ohne CNT-Analyse.

Das applizierte grün fluoreszierende Protein oder GFP wird im Auge, an der mittleren Hinterhirngrenze und in den Trigeminusganglien transgener Embryonen nachgewiesen. Beachten Sie, dass sowohl die GFP-Intensität als auch die Expressionsbereiche erweitert sind. In BCI-behandelten Embryonen wird ein dosisabhängiger Effekt von BCI auf die GFP-Reportergenexpression in transgenen Embryonen beobachtet.

Die Konzentration, die erforderlich war, um ein halbes maximales Ansprechen oder EC 50 hervorzurufen, betrug etwa 12 Mikromolaren. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie transgene Zebrafischembryonen züchten, sammeln und in 96-Well-Platten anordnen können. Wir haben eine zunehmende Konzentration von PCI im eigenen Aktivator des Signalwegs hinzugefügt.

Wir haben auch gezeigt, wie die Bildgebung von transgenen Embryonen automatisiert werden kann, und haben die Bilder mit einem speziell entwickelten Algorithmus analysiert, der auf der Kognitionsnetzwerktechnologie basiert. Mit diesem Ansatz konnten wir die Auswirkungen eines niedermolekularen Aktivators der Signalübertragung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors quantitativ und abgestuft messen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Embryonen sorgfältig auszuwählen, um die Variabilität zwischen den Proben zu minimieren.

Das wars. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.