Name: Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Erfahren Sie automatisierte Bildgebung und Analyse für Hochdurchsatz-Screenings in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode quantifiziert dosisabhängige Effekte kleiner Moleküle auf FGF-Signalwege.

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Diese Arbeit wird durch die NICHD / NIH (1R01HD053287) zu Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), um Vogt und NHLBI / NIH (1R01HL088016) zu Tsang finanziert.

1) Stellen Sie Zebrafisch Paarungen und BCI-Behandlung. <ol><li> Zwei Tage vor der Behandlung, zu identifizieren homozygoten männlichen Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Zebrafisch und Ort individuell in Paarung Tanks 1. Add-Separator und einer Wildtyp-AB * weiblichen Fische und lassen Sie bei der Paarung Käfigen übernachten. </li><li> Am nächsten Morgen nehmen Sie die Trennzeichen und sammeln Embryonen nach 1 Stunde. -Embryonen zu 100mm Gerichte mit E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), Lösung, Inkubation bei 28 ° C für 6 Stunden. Entfernen Sie leere und unbefruchtete Embryonen, fügen frische E3-Lösung und Inkubation über Nacht. </li><li> Sortieren transgenen Embryonen für ähnliche Stufe (24hpf) und einheitliche GFP-Expression. Array Embryonen einzeln in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges E3-Lösung mit der Pipette. Add 200 ul der E3-Lösung mit einem Multi-Kanal-Pipette in jede Vertiefung. </li><li> Fügen Sie die folgenden Verbindungen als aufgelistet: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Endkonzentrationen sind 1 &amp;mgr;, 5 um, 10 um, 20 um, 25 um BCI in 1% DMSO. Abdeckplatte in Alufolie und inkubieren für 6 Stunden bei 28 ° C. </li></ol> 2) Automated Imaging von 96-Well-Platten und-analyse. <ol><li> Add 10 &amp;mgr; l der Tricaine (0,61 mm) in jede Vertiefung zu 30hpf Embryonen zu betäuben. </li><li> Lastplatte in Molecular Devices ImageXpress Ultra. </li><li> Öffnen Metaxpress Software. Wählen Sie eine Konfiguration mit 4-fach Objektiv und maximale Durchmesser der Blende, konfigurieren Laserautofokus auf Plattenboden erkennen und bestimmen optimale Z-Ebene in Regionen von Interesse zu erkennen. Erwerben Sie Bilder auf Anregung / Emissionswellenlängen 488/525 nm (GFP). Set Scan-Bereich als eine einzige Stelle 2000x2000 Pixel (4 x 4 mm) ohne Binning. Konfigurieren Laserleistung und gewinnen, so dass hellsten Regionen in positive Kontrolle Abbildungen müssen nicht sättigen. Überprüfen Sie die Bildaufnahme in mehreren positiven und negativen Kontroll-Wells. </li><li> Starten Platte zu scannen. Das Gerät wird automatisch erwerben Bildern aus allen Vertiefungen und archivieren sie in einer SQL Server-Datenbank. </li><li> Bilder hochladen in Definiens Developer mit dem Cellenger application module und ein Import-Filter, der Bild-Format und Datei-Struktur, die durch die Molecular Devices ImageXpress Ultra-Plattform generiert erkennt. </li><li> Prozess Bilder mit einer speziell entworfenen Cognition Network Technology Algorithmus (auch als einen Regelsatz). Der Algorithmus, den wir Sitte auf einer kürzlich veröffentlichten Regelsatz 2-Basis entwickelt wurde, ist entworfen, um automatisch zu identifizieren Embryo, Eigelb, und Kopf, und die Helligkeit und den Bereich der GFP-exprimierenden Kopf Strukturen zu quantifizieren. Wells, in denen kein Embryo nachgewiesen ist oder wo der Kopf kann nicht eindeutig zugeordnet werden (z. B. mit hoher Verbindung Toxizität oder unscharfe Bilder) werden aus der Analyse ausgeschlossen. Konfigurieren Sie den Algorithmus mit mehreren negativen Kontrolle Bilder (Fahrzeug behandelt) und der positiven Kontrolle Bilder (BCI) behandelt, so dass Kopf und Eigelb richtig in beide identifiziert. Setzen Sie ein "Kopf-Strukturen" Nachweisgrenze als Vielfaches der mittleren Eigelb Intensität bis zur Erkennung von hellen Kopf Strukturen entspricht die visuelle Beobachtung. Definieren Sie Parameter für den Export. In diesem Beispiel wurde die informative Parameter die gesamte integrierte Helligkeit des GFP-positive Regionen innerhalb des Kopfes, nachfolgend als "totalen Kopf Strukturen Helligkeit" (Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Graph depicitng die dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP-Expression in transgenen Embryos. </li><li> Führen Sie den Algorithmus, der auf allen Platten Bilder mit der integrierten Job-Scheduler. Die Definiens-Software verwendet verteiltes Rechnen auf mehreren Prozessoren ("Engines"), wodurch die gleichzeitige Analyse mehrerer Bilder. Der Algorithmus berechnet numerische Maßnahmen auf die Ergebnisse der Bildanalyse, die in der Datenbank gespeichert sind zusammen mit einer Kopie des zu bearbeitenden Bildes mit der Analyse angewendet wird. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Nachdem alle Bilder analysiert werden, können die Daten innerhalb Cellenger visualisiert oder exportiert Software von Drittanbietern (Excel, GraphPad Prism) zur weiteren Analyse und grafische Darstellung. Abbildung 2 zeigt archivierte Bilder scannen aus einem Fahrzeug behandelt und gut, mit und ohne CNT-Analyse angewendet BCI-behandelt. Abbildung 1 Dokumente eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Expression des Reportergens in Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Embryonen. Die Konzentration erforderlich, um eine halbmaximale Reaktion (EC50) zu entlocken war etwa 12 um. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Automatisierte Bilderfassung und Analyse von transgenen Zebrafisch-Embryos. Pt6 Embryo 30hpf: (A) DMSO Fahrzeug Tg (d2EGFP dusp6) behandelt. (B) Transgene Embryonen mit 20 um BCI zeigen behandelt steigt in die GFP-Expression. (C) Bild von Embryos aus (A) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. (D) Bild von Embryos aus (B) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. Beachten Sie, dass der Regelsatz in der Lage, einen erweiterten Bereich der GFP-Expression in den behandelten Embryo zu finden war.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Ein wesentlicher Faktor, der den Durchsatz von Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist der Mangel an Methoden zur systematischen Prozess 96-Well-Platten für die Bildgebung und Analyse. Weil Bilder von vielzelligen Organismen komplexer, geringem Kontrast sind und heterogener Natur, nicht vorhandenes Bild-Analyse-Algorithmen zur Detektion und Quantifizierung spezifischer Strukturen innerhalb des Organismus. Die meisten veröffentlichten Zebrafisch chemische Bildschirme sind daher mit visuellen Prüfung der einzelnen Vertiefungen durch engagierte Mitarbeiter während des gesamten Verfahrens. Normalerweise verhindert die Erzeugung von numerischen Anzeigen und eine vollständige Archivierung der Bildschirm Bilder und Daten. Darüber hinaus entfällt die manuelle Auswertung einige wesentliche Vorteile von image-based Screening, das heißt die Fähigkeit, retrospektive Analysen von Screen-Performance durchzuführen, um phänotypische Veränderungen, die nicht der primäre Fokus des Screening-Kampagne (zB Toxizität oder Entwicklungsstörungen) zu untersuchen und Kreuz -Referenz-Screening-Daten mit Vergangenheit oder Zukunft Bildschirme mit der gleichen Verbindung Bibliothek. In diesem Bericht haben wir Highlight Methodik zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen in Mikrotiterplatten ohne Eingreifen des Benutzers. Wir automatisierte Bildaufnahme auf einem ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), um Bild Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Embryonen in 96-Well-Platten und entwickelte eine Bildanalyse-Algorithmus auf Definiens Cognition Network Technology, die quantifiziert GFP basiert Ausdruck in den Köpfen der transgenen Embryos. Die Methode geliefert abgestuften Antworten und quantifiziert die in-vivo-Aktivität eines kleinen Moleküls Aktivator von FGF-Signalisierung. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Epifluoreszenz-basierte ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) erhalten zu dokumentieren, dass es möglich ist, automatisierte Bildaufnahme von Zebrafisch-Embryonen auf eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Platereader 2 getroffen haben. Die Entwicklung von Methoden zur automatischen Analyse vielzelligen Organismus Bildern eliminiert die Notwendigkeit für die visuelle Scoring durch einen menschlichen Beobachter und aktiviert die Generierung und Archivierung von numerischen Daten und Bilder für retrospektive Analysen und Vergleiche mit Zukunft Bildschirme.

<table><tbody><tr><td>Tricain (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung von automatisierten imaging und analyse für zebrafisch chemische bildschirme.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Wir demonstrieren die Anwendung der Image-basierten High-Content-Screening (HCS)-Methode, um kleine Moleküle, die Modulation der FGF / RAS / MAPK-Weg kann in Zebrafisch-Embryonen zu identifizieren. Der Zebrafisch Embryo ist ein ideales System für In-vivo-High-Content-chemischen Bildschirme. Die 1-Tage alten Embryo ist ca. 1mm im Durchmesser und lässt sich einfach in 96-Well-Platten, ein Standardformat für das Hochdurchsatz-Screening angeordnet werden. Während der ersten Tage der Entwicklung, sind Embryonen transparent mit den meisten der wichtigsten Organe vorhanden, so dass Visualisierung von Gewebe-Bildung während der Embryogenese. Die vollständige Automatisierung der Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist immer noch eine Herausforderung, aber vor allem in der Entwicklung von automatisierten Bildaufnahme und-analyse. Wir zuvor generierte eine transgene Reporter Linie, grün fluoreszierende Protein (GFP) bringt unter der Kontrolle von FGF-Aktivität und demonstriert deren Nutzen in der chemischen-Bildschirme<sup&gt; 1</sup&gt;. Um festzustellen, Methodik für hohen Durchsatz gesamten Organismus Bildschirme, entwickelten wir ein System für die automatisierte Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen bei 24-48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) in 96-Well-Platten<sup&gt; 2</sup&gt;. In diesem Video stellen wir die Verfahren für Anordnen transgenen Embryonen in Mikrotiterplatten bei 24hpf und die Zugabe eines kleinen Moleküls (BCI), dass FGF-Signale hyperactivates<sup&gt; 3</sup&gt;. Die Platten werden für 6 Stunden durch die Zugabe von Tricaine Larven vor Automated Imaging auf einem Molecular Devices ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale HCS Leser betäuben gefolgt inkubiert. Die Bilder werden von Definiens Developer-Software mit einer Cognition Network Technology Algorithmus, die wir entwickelt, um nachzuweisen und zu quantifizieren Expression von GFP in den Köpfen der transgenen Embryos verarbeitet. In diesem Beispiel heben wir die Fähigkeit des Algorithmus, um eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Reportergen-Expression in den behandelten Embryonen zu messen.

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

Wir demonstrieren die Anwendung einer bildbasierten High-Content-Screening-Methodik (HCS), um kleine Moleküle zu identifizieren, die den FGF/RAS/MAPK-Signalweg modulieren können ...

In diesem Video wird eine bildbasierte Hochdurchsatz-Screening-Methode durchgeführt, um die Modulation des Fibroblastenwachstumsfaktor-Ras-MAP-Kinase-Signalwegs durch kleine Moleküle in Zebrafischembryonen zu untersuchen. Transgene männliche und Wildtyp-weibliche Zebrafische werden in einem Zuchtkäfig verpaart. Die befruchteten Eier fallen nach unten und werden gesammelt sowie in eine Petrischale überführt. Die Embryonen werden über Nacht inkubiert und anschließend in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte gegeben.Das kleine Molekül BCI wird hinzugefügt, um die FGF-Signalübertragung zu verstärken, und die Platte wird sechs Stunden lang inkubiert. Bilder aus jedem Well werden mit einem konfokalen Plattenreader aufgenommen und mithilfe eines selbstentwickelten Algorithmus analysiert, der die Fluoreszenzintensitäten in bestimmten embryonalen Strukturen angibt. Hallo, ich bin Hiba Kado aus dem Labor von Dr. Michael Chang an der Abteilung für Mikrobiologie und molekulare Genetik an der University of Pittsburgh.Hallo, ich bin Andrea Spock vom Drug Discovery Institute der University of Pittsburgh. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Zucht, Auswahl und Anordnung von Zebrafischembryonen für chemische Behandlungen. In einer 96-Loch-Platte verwenden wir transgene Embryonen, die über Fibroblastenwachstumsfaktor-Aktivitäten berichten, und behandeln sie mit einem Molekül, das diesen Signalweg überaktiviert.Wir zeigen Ihnen, wie wir mithilfe der Hochdurchsatz-Screening-Methode die Aktivität des Fibroblastenwachstumsfaktors in transgenen Zebrafischembryonen automatisch erfassen, analysieren und quantifizieren. Dieses Verfahren verdeutlicht die Plattformtechnologie zur Nutzung transgener Zebrafische und chemischer Hochdurchsatz-Screens. Beginnen wir also.Zwei Tage vor der Behandlung homozygote männliche transgene Zebrafische identifizieren und in einzelne Paarungstanks platzieren. Trennwände in die Tanks einsetzen, dann jeweils einen Wildtyp-Weibchenfisch hinzufügen und die Fische über Nacht bei 28 Grad Celsius in den Paarkäfigen belassen. Am nächsten Morgen die Trennwand entfernen. Nach einer Stunde die Fische in einen neuen Tank verbringen und die Embryonen in ein Plastiksieb gießen.Überführen Sie die Embryonen in 100-Millimeter-Schalen mit E3-Lösung und inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius für sechs bis acht Stunden. Nach der Inkubation untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop. Für Experimente geeignete Embryonen befinden sich in der Gasphase.Zu diesem Zeitpunkt sollten alle unbefruchteten Embryonen entfernt werden, die im Einzelzellstadium verbleiben. Entfernen Sie außerdem nicht lebensfähige Embryonen, die trüb oder fehlerhaft geformt erscheinen. Anschließend frische E3-Lösung hinzufügen und über Nacht bei 28 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag die Embryonen unter ein fluoreszierendes Stereomikroskop stellen, um transgene Embryonen nach ähnlichem Entwicklungsstadium und gleichmäßiger GFP-Expression zu sortieren. Bei 24 HPF zeigen die Embryonen eine sichtbare Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn mit intensiver GFP-Expression sowie gut ausgebildete Augen mit GFP-positiven dorsalen Netzhäuten. Diese Embryonen sind aktiv und bewegen sich innerhalb ihres Keimblases, wobei sie mit einer plastischen Pasteurpipette zappeln und wackeln.Überführen Sie die 24 HPF-Embryonen einzeln in einzelne Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Entfernen Sie mithilfe einer Mikropipette jegliche überschüssige E-drei-Lösung aus den Vertiefungen. Fügen Sie anschließend mit einem Mehrkanalpipettierer 200 Mikroliter E-drei-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu.Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter DMSO in alle Vertiefungen der Spalten eins und 12 hinzu. Geben Sie dann zwei Mikroliter BCL, das in DMSO vorbereitet wurde, wie folgt hinzu: ein Mikromolar in die Spalten zwei und sieben, fünf Mikromolar in die Spalten drei und acht, 10 Mikromolar in die Spalten vier und neun, 20 Mikromolar in die Spalten fünf und zehn.Mikromolar in die Spalten fünf und 10. Und schließlich 25 Mikromolar in die Spalte sechs und 11. Decken Sie die Platte nun mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie sechs Stunden bei 28 Grad Celsius.Fügen Sie 10 Mikroliter Trica pro Vertiefung hinzu, um die 30 HPF-Embryonen zu anästhesieren. Danach laden Sie die Platte in die Molecular Devices ImageXpress Ultra Open MetaXpress-Software. Wählen Sie eine Konfiguration mit einem Forex-Objektiv und maximalem Pinhole-Durchmesser.Konfigurieren Sie den automatischen Laser-Fokus so, dass er den Plattenboden erkennt, und verwenden Sie einen vorbestimmten optimalen Z-Offset. Um die Regionen von Interesse zu detektieren, legen Sie den Scan-Bereich als einzelnen Ort mit 2000 mal 2000 Pixeln ohne Benning fest. Wählen Sie den geeigneten Plattentyp sowie den 488 Nanometer Argonlaser bei Anregung über Emissionswellenlängen von 488 über 525 Nanometern aus.Wählen Sie anschließend eine Vertiefung mit einem mit dem Fahrzeug behandelten Embryo aus und klicken Sie auf „Probe finden“. Das Gerät führt einen automatischen Fokussier-Scan durch und erfasst ein einzelnes Bild, um die korrekte Bildaufnahme zu bestätigen. Wählen Sie zufällig eine mit dem Fahrzeug behandelte Vertiefung aus und erfassen Sie ein Bild.Wenn das Bild scharf ist und die GFP-Expression im Kopf zeigt. Positionieren Sie den Cursor über den hellsten Bereichen und überprüfen Sie, ob die Fluoreszenzintensität innerhalb des Bereichs der 16-Bit-Kamera liegt. Weniger als 65.000 Einheiten.Wiederholen Sie diese Schritte mit einer weiteren Fahrzeugkontrolle und einigen Brunnen, die mit der Testverbindung behandelt wurden. Passen Sie gegebenenfalls die Laserleistung und den Verstärkungsfaktor so an, dass die hellsten Bereiche in den Positivkontrollbildern nicht sättigen. Wählen Sie anschließend im Fenster für die Plattenakquise und -steuerung „Platte akquirieren“, um den Plattenscan zu starten.Das Instrument erfasst automatisch ein Bild pro Vertiefung für die gesamte Mikroplatte und archiviert diese in einer SQL-Server-Datenbank. Sobald der Scan abgeschlossen ist, laden Sie die Bilder in D definition's Developer hoch, indem Sie Developer mit aktivierter Slinger-Option öffnen.Erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich. Wählen Sie dann im Dateimenü den benutzerdefinierten Import aus. Navigieren Sie anschließend zu dem Ordner, der die Bilder enthält, und öffnen Sie eine Beispieldatei.Wählen Sie einen Importfilter aus, der das vom Molecular Devices ImageXpress Ultra-Plattform erzeugte Bildformat und die Dateistruktur erkennt. Öffnen Sie nun ein Kontrollbild, um die gewünschte Cognition Network Technology (CNT) oder den entsprechenden Algorithmus bzw. Regel-Set zur Bildverarbeitung zu laden. Der hier verwendete benutzerdefinierte Algorithmus wurde entwickelt, um Embryo, Dottersack und Kopf automatisch zu identifizieren und Helligkeit sowie Fläche der GFP-exprimierenden Kopfstrukturen zu quantifizieren. Führen Sie das Regel-Set bis zum Schritt der Erkennung von Kopf und Dottersack aus.Um eine korrekte Zuordnung von Dottersack und Kopf sicherzustellen, passen Sie den Regelsatz an, um die Dottersack-Erkennungsschwelle anzupassen, falls der Dottersack zu groß oder zu klein ist. Führen Sie anschließend den Regelsatz bis zum Stadium der Erkennung heller Kopfstrukturen aus. Um eine korrekte Zuordnung der GFP-exprimierenden Bereiche im Kopf sicherzustellen, modifizieren Sie den Regelsatz, um die Erkennungsschwelle für Kopfstrukturen als Vielfaches der minimalen Intensität anzupassen, bis die Erkennung heller Kopfstrukturen mit der visuellen Beobachtung übereinstimmt.Als Nächstes führen Sie den gesamten Regelsatz manuell an mehreren zufällig ausgewählten Bildern durch, die von mit Vehicle behandelten Embryonen sowie von positiven Kontrollbildern aus mit PCI behandelten Embryonen stammen. Um den Algorithmus auf allen Plattenbildern auszuführen, wählen Sie die zu analysierenden Platten aus und wählen Sie „Analysieren“. Navigieren Sie anschließend zum optimierten Regelsatz und analysieren Sie alle Wells.Mithilfe des integrierten Job-Schedulers werden leere Wells oder mehrdeutige Bilder während des Scans automatisch von der Analyse ausgeschlossen. Eine fortlaufend aktualisierte Keep-Map wird angezeigt. Sowohl die Daten als auch die Bilder sind während des Laufs zur visuellen Überprüfung zugänglich.Die numerischen Daten und verarbeiteten Bilder werden automatisch gespeichert. Nachdem alle Bilder analysiert wurden, können die Daten in Software von Dritten wie Excel, GraphPad oder Prism exportiert werden. Diese Abbildung zeigt archivierte Scan-Bilder aus einer mit Vehicle und einer mit BCI behandelten Probe mit und ohne CNT-Analyse.Das angewandte grüne Fluoreszenzprotein oder GFP wird im Auge, an der Grenze zwischen Mittel- und Hinterhirn sowie in den Ganglien des Nervus trigeminus transgener Embryonen nachgewiesen. Beachten Sie, dass sowohl die GFP-Intensität als auch die Expressionsbereiche erweitert sind. Bei den hier behandelten BCI-Embryonen ist eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf die Expression des GFP-Reportergens in transgenen Embryonen zu beobachten.Die Konzentration, die erforderlich ist, um eine halbmaximale Wirkung oder EC 50 hervorzurufen, betrug etwa 12 Mikromolar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man transgene Zebrafischembryonen züchtet, sammelt und in 96-Well-Platten anordnet. Wir haben steigende Konzentrationen von PCI zum eigenen Aktivator des Signalwegs hinzugefügt.Wir haben außerdem gezeigt, wie die Bildgebung transgener Embryonen automatisiert werden kann, und die Bilder mit einem eigens entwickelten Algorithmus basierend auf Kognitionstechnologie ausgewertet. Mit diesem Ansatz konnten wir die Wirkungen eines kleinen molekularen Aktivators des Fibroblastenwachstumsfaktor-Signalwegs quantitativ und gestuft messen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Embryonen sorgfältig auszuwählen, um die Variabilität zwischen den Proben zu minimieren.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.​

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Biologie

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Wir beschreiben den Arbeitsablauf und die Datenanalyse eines Screening-Systems zur Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen basierend auf der Vibrationsschreckreaktion des Zebrafischembryos. Das System zeichnet die Bewegungen von Zebrafischembryonen bei Exposition gegenüber einem Vibrationsreiz auf und ermöglicht eine integrierte Bewertung der allgemeinen Toxizität/Letalität und der neuromuskulären Toxizität.

Bewertung der Toxizität von Chemikalien mit einem Zebrafisch-Vibrations-Startle-Response-Screening-System

Erfahren Sie automatisierte Bildgebung und Analyse für Hochdurchsatz-Screenings in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode quantifiziert dosisabhängige Effekte kleiner Moleküle auf FGF-Signalwege.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

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