Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Elektroporation siRNAs in schwer zu transfectierende Zellen einzubringen, um die Genexpression zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die benötigte Menge an Zellsuspension mit dem automatisierten Zellzähler TC 10 bestimmt wird. Anschließend wird irna zur Zellsuspension hinzugefügt, und die Zellen werden elektroporiert.

Mit dem MXL-Elektroporationssystem werden die Zellen 24 Stunden nach der Elektroporation inkubiert. Anschließend wird IL-4 hinzugefügt, um die Genexpression in den experimentellen Zellen zu induzieren. Abschließend wird RNA isoliert und mittels Echtzeit-PCR die Expression des Gens gemessen.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Effekt spezifischer siRNAs auf Genexpressionswege zeigen. Hallo, ich bin Adam McCoy, leitender Wissenschaftler der Abteilung Genexpression bei Bio Rad Laboratories. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Einführung von RNAs in schwer zu transinfizierende Zelllinien mittels Elektroporation und anschließend die Auswirkungen auf die Genexpression.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Genexpression einzelner Gene zu analysieren oder Genwege zu untersuchen, indem ein Gen ausgeschaltet und nach downstream-Effekten gesucht wird. Beginnen wir also. Arbeiten Sie unter einer Zellkulturhaube und entfernen Sie die Zellen aus einem Kulturgefäß.

Die in diesem Protokoll verwendeten Zellen sind Suspensionzellen. Wenn Sie anheftende Zellen verwenden, müssen Sie diese vor dem Entfernen mit Trypsin behandeln. Zentrifugieren Sie die Zellen, um sie zu pelletieren.

Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in PBS. Um die Anzahl der lebenden Zellen zu bestimmen, entnehmen Sie eine Aliquot aus der Zellsuspension und geben Trypanblau-Färbung im Verhältnis 1:1 zu, um die toten Zellen anzufärben. Trypanblau ist für die Unterscheidung von lebenden und toten Zellen erforderlich, jedoch nicht für die Gesamtzellzählung.

Geben Sie die Mischung nur auf die Öffnung eines Einweg-Zählrasters und schieben Sie es in den automatischen Zellzähler TC 10. Der TC 10 stellt zunächst automatisch den Fokus ein, um die genaueste Zählung sicherzustellen, und beginnt anschließend mit dem Zählen der Zellen. Die Anzahl der lebenden und der Gesamtzellzahl pro Milliliter in der Probe wird angezeigt.

Wählen Sie „Bild anzeigen“, um die Zellen auf dem Anzeigeschirm darzustellen. Verwenden Sie dann die Pfeiltasten nach oben oder unten. Zoomen Sie nach Bedarf hinein oder heraus, um die Menge der Zellsuspension zu berechnen, die für die Experimente benötigt wird; wählen Sie dazu den Verdünnungsrechner aus.

Geben Sie die gewünschte Konzentration und das endgültige Volumen für diesen Versuch ein. Es werden insgesamt 16 Proben vorbereitet, einschließlich der Duplikate für jede Behandlung. Daher werden insgesamt 3,6 Milliliter einer Suspension mit fünf mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter benötigt.

Der Zellzähler meldet dann das benötigte Volumen der Zellsuspension basierend auf der Anzahl lebender Zellen und den eingegebenen Zielwerten. Falls TRIAM-Blau verwendet wurde, passt der Zähler automatisch die Verdünnung im Verhältnis 1:1 an. Übertragen Sie nun unter einem Abzug das berechnete Volumen der Zellsuspension in ein neues Röhrchen.

Dann die Zellgemische zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren, während die Zellen absinken. Mikrozentrifugenröhrchen für die Elektroporation vorbereiten, indem SIR A zu jedem Röhrchen gegeben wird. Für dieses Experiment werden eine Kontrolle irna, zwei stat sechs spezifische siRNAs und unbehandelte Kontrollen vorbereitet. Nach der Zentrifugation das PBS entfernen und die Zellen in 3,6 Milliliter Gene-Pulser-Elektroporationspuffer resuspendieren. 800-Mikroliter-Aliquote in die Röhrchen mit dem entsprechenden IRNA überführen und vorsichtig mischen.

Die Zellen sind nun bereit für die Elektroporation, um alle Proben gleichzeitig zu bearbeiten. Überführen Sie mit dem MXL-Elektroporationssystem jeweils 150 Mikroliter der Zellsuspension in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Loch-Elektroporationsplatte. Danach platzieren Sie die Platte in die Plattenkammer des MXL-Elektroporationssystems und schließen den Deckel.

Wählen Sie das gewünschte Elektroporationsprotokoll aus und drücken Sie den Puls. Sobald die Elektroporation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus dem Gerät und überführen die Zellen in eine neue Zellkulturplatte, die mit vorgewärmtem Medium gefüllt ist. Danach übertragen Sie 150 Mikroliter nicht behandelte Kontrollzellen für jede Probe in die neue Schale. Anschließend inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach 24 Stunden verwenden Sie IL-4, um die Gen-Transkription in einem Satz von Zellen zu induzieren, und geben nur Medium zum zweiten Satz hinzu. Ein IL-4 wird den Zellen zugesetzt. Inkubieren Sie weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, nach insgesamt 48 Stunden Wachstum.

Es kann große Unterschiede in der Zelldichte geben, wenn die experimentelle Behandlung die Zellteilung beeinflusst. Daher ist es ratsam, den automatischen Zellzähler TC 10 zu verwenden, um die Zellen anhand der Zellzahlen erneut schnell zu zählen. Überführen Sie ein Aliquot aus jedem Well in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Extraktion und frieren Sie es ein.

Ein zweiter Aliquot für die Westernblot-Analyse oder andere Proteinanalysen. Heute wird nur der RNA-Arbeitsablauf gezeigt. Zentrifugieren Sie die Proben, um die Zellen zu pelletieren.

Entfernen und verwerfen Sie anschließend das SUP Natin aus jedem Röhrchen. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion unter Verwendung des Orum Total-RNA-Kits fort. Sobald die RNA extrahiert wurde, führen Sie unverzüglich die Analyse durch und halten Sie die Proben auf Eis.

Um die RNA-Qualität und -Menge in einem Schritt zu überprüfen, verwenden Sie die automatisierte Elektrophoresestation Experian, um die Proben hitzedenaturieren und den Experian RNA-Ladder vorzubereiten und auf Eis zu stellen. Geben Sie eine vorbereitete Mischung aus Gel und Farbstoff zur Priming-Reaktion hinzu. Füllen Sie die Vertiefung auf einem RNA-Chip und stellen Sie den Priming-Code an der Priming-Station ein.

Platzieren Sie den Chip in der automatischen Anwärmstation und drücken Sie Start. Entfernen Sie den Chip aus der Anwärmstation und laden Sie den Chip. Vortexen Sie den Chip, um die Proben mit dem Lade-Puffer zu mischen.

Platzieren Sie den Chip in die Elektrophoresestation und starten Sie den Lauf. Die Experian-Software zeigt die Ergebnisse automatisch in Form eines Elektropherogramms, einer Ergebnistabelle mit RNA-Konzentration, ribosomalem Verhältnis und der RNA-Qualitätsindikatorzahl, sowie eines virtuellen Gels an, das einem herkömmlichen RNA-Gel ähnelt. Hochwertige Gesamt-RNA-Proben weisen typischerweise einen RQI von acht bis 10 auf.

Nach Überprüfung der RNA-Qualität bereiten Sie hier die CDNA-Reaktionen vor. Die IS-Skript-ONEstep-R-T-P-C-R-Mischung wird verwendet, um die CDNA-Synthese und die Echtzeit-PCR zu kombinieren. Stellen Sie in einer Reaktion eine Master-Mischung her, die alle Reaktionsbestandteile mit Ausnahme der RNA-Vorlagen für jeden Primer-Satz enthält.

Verteilen Sie die Mischung anschließend in die Vertiefungen einer PCR-Platte. Nach der Verdünnung der RNA auf eine einheitliche Konzentration werden die Proben den entsprechenden Vertiefungen triplicat zugegeben. Verschließen Sie die Platte, geben Sie sie in die Echtzeit-PCR-Maschine und wählen Sie das geeignete Protokoll aus. Starten Sie den Durchlauf. Sobald der Durchlauf abgeschlossen ist, verwenden Sie die Echtzeit-Kurven, um die Expressionsniveaus zu bestimmen.

Die Software berechnet die normalisierte Genexpression aus den Daten basierend auf der relativen Expression von experimentellen und Referenzgenen in behandelten und kontrollierten Zellen. Diese Abbildung zeigt einen Überblick über den IL-4-Signalweg: Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor führt zur Dimerisierung und Aktivierung von STAT6; das aktivierte STAT6 transloziert in den Zellkern und aktiviert die Transkription seiner Zielgene.

Gene wie CCL 17 ohne IL-4-Induktion verbleiben nach der durch irna vermittelten Stilllegung des STAT6-Gens auf niedrigem konstitutiven Niveau. Die Behandlung mit IL-4 sollte zu einer geringen oder nicht nachweisbaren Zunahme der CCL-17-Expression führen. Die Induktion von CCL 17 durch IL-4 wurde unter verschiedenen Bedingungen mittels quantitativer Echtzeit-PCR gemessen.

PCR-Proben, die ohne IL-4 gezüchtet wurden, wiesen einen niedrigen konstitutiven Expressionsgrad auf. Unabhängig vom sir reagierten die als grün und blau dargestellten Kontrollproben normal auf die Behandlung mit IL-4, wobei eine 8- bis 10-fache Induktion von CCL17 erfolgte. Zellen hingegen, die mit siRNAs, die gegen STAT6 gerichtet waren (rot und pink dargestellt), transfiziert wurden, zeigten eine verminderte Expression von CCL17 als Reaktion auf IL-4, was die Vorstellung unterstützt, dass STAT6 eine Rolle bei der IL-4-induzierten Expression von CCL17 spielt.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man por-siRNAs in eine schwer zu transfizierende Suspensionzelllinie einführt und wie man die Genexpression in diesen Zellen verfolgt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Bedingungen zwischen den Proben so konsistent wie möglich zu halten. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.