Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, siRNAs mittels Elektroporation in schwer zu transfizierende Zellen einzubringen, um die Genexpression zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Menge der benötigten Awa-Zellsuspension mit dem TC 10 bestimmt wird. Anschließend wird der Zellsuspension ein automatisierter Zellzähler irna zugesetzt und die Zellen werden elektroisch erzeugt.

Mit dem MXL-Elektroporationssystem werden die Zellen nach der Elektroporation 24 Stunden lang inkubiert. Dann wird IL vier hinzugefügt, um die Gentranskription in experimentellen Zellen zu induzieren. Schließlich wird RNA extrahiert und die Echtzeit-PCR verwendet, um den Grad der Genexpression zu messen.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Wirkung spezifischer siRNAs auf die Genexpressionswege zeigen. Hallo, ich bin Adam McCoy, leitender Wissenschaftler für die Genexpressionsabteilung von Bio Rad Laboratories. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zum Einbringen von RNAs in eine schwer zu transfizierende Zelllinie durch Elektroporation und schauen uns dann die Auswirkungen auf die Genexpression an.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Genexpression einzelner Gene zu analysieren oder Genwege zu untersuchen, indem wir ein Gen ausschalten und nach nachgelagerten Effekten suchen. Also lasst uns loslegen. Entnehmen Sie die Zellen unter einer Zellkulturhaube aus einem Kulturkolben.

Bei den in diesem Protokoll verwendeten Zellen handelt es sich um Suspensionszellen. Wenn Sie adhärente Zellen verwenden, müssen Sie die Augen trypsinieren, bevor Sie sie entfernen. Zentrifugieren Sie die Zellen, um sie zu pelletieren.

Nachdem die Zellen heruntergeschleudert wurden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in PBS. Um die Anzahl der lebenden Zellen zu bestimmen, nehmen Sie ein Aliquot der Zellsuspension und fügen Sie Trianblau-Färbung im Verhältnis eins zu eins hinzu, um die abgestorbenen Zellen zu färben. Trianblau ist für die Beurteilung lebender toter Zellen erforderlich, aber nicht für die Gesamtzellzahl.

Spritzen Sie das Gemisch nur auf die Öffnung eines Einweg-Zählschiebers und setzen Sie es in den automatischen Zellzähler TC 10 ein. Der TC 10 fokussiert zuerst automatisch, um die genaueste Zählung zu gewährleisten, und dann beginnen wir mit der Zählung der Zellen. Die Anzahl der lebenden Zellen und die Gesamtzahl der Zellen pro Milliliter in der Probe wird angezeigt.

Wählen Sie Bild anzeigen, um die Zellen auf dem Ansichtsbildschirm anzuzeigen. Verwenden Sie dann die Pfeile nach oben oder unten. Vergrößern oder verkleinern Sie je nach Bedarf, um die für Experimente benötigte Menge an Zellsuspension zu berechnen, wählen Sie Verdünnungsrechner aus.

Geben Sie die gewünschte Konzentration und das endgültige Volumen für dieses Experiment ein. Es werden insgesamt 16 Proben vorbereitet, einschließlich Duplikate für jede Behandlung. Insgesamt werden also 3,6 Milliliter von einem fünfmal 10 der sechs Zellen pro Milliliter Suspension benötigt.

Der Zellzähler meldet dann das benötigte Volumen der Zellsuspension basierend auf der Anzahl der lebenden Zellen und den eingegebenen Zielwerten. Wenn TRIAM blue verwendet wurde, passt sich der Zähler automatisch an die verwendete Eins-zu-Eins-Verdünnung an. Übertragen Sie nun unter einer Haube das berechnete Volumen der Zellsuspension in ein neues Röhrchen.

Dann drehen Sie die Zellmischungen, um die Zellen zu pelletieren, während sich die Zellen nach unten drehen. Bereiten Sie Mikro-Fuge-Röhrchen für die Elektroporation vor, indem Sie SIR A zu jedem Röhrchen hinzufügen. Für dieses Experiment werden eine Kontrolle von zwei und sechs spezifische siRNAs und nicht resezierte Kontrollen hergestellt. Nach der Zentrifugation wird das PBS entfernt und die Zellen in 3,6 Millilitern Gen-Pulser-Elektroporationspuffer resuspendiert, 800 Mikroliter Aliquote in Röhrchen mit der entsprechenden IRNA übertragen und vorsichtig gemischt.

Die Zellen sind nun bereit für die Elektroporation, um alle Proben gleichzeitig zu essen. Mit dem MXL-Elektroporationssystem werden 150 Mikroliter jeder Zellsuspension in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Elektroporationsplatte überführt. Legen Sie anschließend die Platte in die Plattenkammer des MXL-Elektroporationssystems und schließen Sie den Deckel.

Wählen Sie das gewünschte Elektroporationsprotokoll aus und drücken Sie Puls, um die Zellen nach Abschluss der Elektroporation zu essen, entfernen Sie die Platte aus dem Instrument und übertragen Sie die Zellen in eine neue Gewebekulturplatte, die Prewarm to Medium enthält. Übertragen Sie als Nächstes 150 Mikroliter nicht bewertete Kontrollzellen für jede Probe in die neue Schale. Setzen Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid ein.

Nach 24 Stunden verwenden Sie IL four, um die Gentranskription in einer Gruppe von Zellen zu induzieren, und fügen Sie nur der zweiten Gruppe Medium hinzu. Den Zellen wird ein IL vier hinzugefügt. Inkubieren Sie weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach insgesamt 48 Stunden Wachstum.

Es kann zu großen Unterschieden in der Zelldichte kommen, wenn die experimentelle Behandlung die Zellteilung beeinflusst. Es bietet sich also an, den automatisierten Zellzähler TC 10 zu verwenden, um die Zellen anhand der Zellzahlen schnell wieder zu zählen. Übertragen Sie ein Aliquot aus jeder Vertiefung in ein Mikrofuge-Röhrchen zur RNA-Extraktion und frieren Sie es ein.

Ein zweites Aliquot für Western Blotting oder andere Proteinanalysen. Heute wird nur der RNA-Workflow gezeigt. Zentrifugieren Sie die Proben, um die Zellen zu pelletieren.

Entfernen und entsorgen Sie dann das SUP-Natin aus jedem Schlauch. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion mit dem Orum-Gesamt-RNA-Kit fort. Sobald die RNA extrahiert wurde, fahren Sie sofort mit der Analyse fort und bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

Um die Qualität und Quantität der RNA in einem Schritt zu überprüfen, verwenden Sie die automatisierte Elektrophoresestation von Experian, um die Proben zu denaturieren, und die Experian RNA-Leiter und legen Sie sie auf Eis. Fügen Sie eine vorbereitete Mischung aus dem Gel und der Beize zur Grundierung hinzu. Nun, auf einem RNA-Chip setzen Sie den Priming-Code auf der Priming-Station.

Legen Sie den Chip in die automatische Ansaugstation und drücken Sie Start. Entfernen Sie den Chip aus der Ansaugstation und legen Sie den Chip ein. Den Chip vortexen, um Proben mit Ladepuffer zu mischen.

Setzen Sie den Chip in die Elektrophoresestation ein und starten Sie den Lauf. Die Experian-Software zeigt die Ergebnisse automatisch in Form eines Elektropherogramms an, einer Ergebnistabelle, die das ribosomale Verhältnis der RNA-Konzentration anzeigt, und der Nummer des RNA-Qualitätsindikators sowie eines virtuellen Gels, das einem herkömmlichen RNA-Gel ähnelt. Qualitativ hochwertige Gesamt-RNA-Proben haben in der Regel einen RQI von acht bis 10.

Nachdem Sie die RNA-Qualität überprüft haben, bereiten Sie hier die CD-NA-Reaktionen vor. Der IS-Skript ONEstep R-T-P-C-R Mix wird verwendet, um die CD-NA-Synthese und die real-time PCR zu kombinieren. Stellen Sie in einer Reaktion einen Mastermix her, der alle Reaktionskomponenten mit Ausnahme der RNA-Templates für jedes Primer-Set enthält.

Verteilen Sie dann die Mischung in die Vertiefungen einer PCR-Platte. Nachdem Sie die RNA auf eine gleichmäßige Konzentration verdünnt haben, geben Sie die Proben in die entsprechenden Vertiefungen und verdreifachen Sie sie. Versiegeln Sie die Platte, legen Sie sie in das Realtime-PCR-Gerät, wählen Sie dann das entsprechende Protokoll aus und beginnen Sie den Lauf, sobald der Lauf abgeschlossen ist, verwenden Sie die Echtzeit-Traces, um die Expressionsniveaus zu bestimmen.

Die Software berechnet die normalisierte Genexpression aus den Daten auf der Grundlage der relativen Expression von experimentellen und Referenzgenen in behandelten und kontrollierten Zellen. Diese Abbildung zeigt einen Überblick über die Bindung von IL four an seinen Rezeptor durch den IL four-Signalweg. Führt zur Diarisierung und Aktivierung von STAT sechs, aktivierter STAT sechs transloziert in den Zellkern und aktiviert die Transkription seines Ziels.

Gene wie CCL 17 ohne IL-4-Induktionstranskription von CCL 17 bleiben nach irna-vermitteltem Silencing des STAT-6-Gens auf einem niedrigen konstitutiven Niveau. Die Behandlung mit IL vier sollte zu einer geringen oder keiner Erhöhung der CCL 17-Expression führen. Die Induktion von CCL 17 durch IL four wurde unter verschiedenen Bedingungen mittels quantitativer Echtzeit gemessen.

PCR-Proben, die ohne IL vier gezüchtet wurden, wiesen ein niedriges konstitutives Expressionsniveau auf. Unabhängig vom sir sprach die Entbindung von A, wie in den grünen und blauen Kontrollproben gezeigt, normal auf die Behandlung mit IL vier an, wobei CCL 17 acht- bis zehnfach induziert wurde. Zellen, die mit siRNAs transfiziert wurden, die auf STAT sechs abzielen und in Rot und Rosa dargestellt sind, hatten jedoch eine verminderte CCL L 17-Expression als Reaktion auf IL 4, was die Idee unterstützt, dass STAT 6 eine Rolle bei der IL four-induzierten Expression von CCL 17 spielt.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man siRNAs in eine schwer zu transfizierende Suspensionszelllinie poriert und wie man eine Genexpression in diesen Zellen verfolgt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Stichproben so konsistent wie möglich sind. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.