Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, große Proteinanordnungen mit Hilfe der strukturellen Massenspektrometrie zu charakterisieren. Dies wird durch die Vorbereitung vergoldeter Kapillaren für die Nano-Flow-Elektrospray-Ionisation erreicht. In einem zweiten Schritt wird die Probe vorbereitet und das Massenspektrometer für Messungen mit hoher Masse kalibriert.

Anschließend werden die experimentellen Bedingungen optimiert, um die Proteinkomplexe in der Gasphase intakt zu halten. MS und Tandem Ms.Spectra werden dann erfasst. Die MS-Spektren zeigten Ladungszustände, die in ihrer Masse dem intakten Komplex entsprachen, während Tandem-MS-Experimente ein Assoziationsmuster von Monomeren und gestrippten Komplexen ergaben.

Hallo, ich bin Naam Kiba vom Labor von Miron im Whiteman Institute of Science, und ich bin Isaac Ky, ich bin auch vom Labor von Michelon. Heute möchten wir Ihnen das grundlegende Verfahren zur Analyse großer Proteinkomplexe unter Anwendung der Strukturspektrometrie zeigen, und wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Proteinkomplexe zu charakterisieren, um Ihre Stammgeometrie, Zusammensetzung und Interaktionsnetzwerke zu definieren. Also lasst uns loslegen.

Die Analyse von nicht-stromgebundenen Proteinkomplexen erfolgt mittels Luftspray-Immunisierungstechnik unter Verwendung von Emme Plus oder a qua Kapillaren. Dieses Kapillar-C kann auf eine feine Spitze von etwa einem Mikrometer Durchmesser gezogen und dann mit leitendem Material wie Gold beschichtet werden. Diese Kapillaren sind im Handel erhältlich, wie Sie hier sehen können.

Es ist jedoch viel kostengünstiger in der Anwendung. Die Glaskapillaren, eh, die dann abgekühlt und bis zum gebrauchsfertigen Zustand beschichtet werden können, werden auf dieser Nadelpooling-Vorrichtung durchgeführt und auf dieser eh-Beschichtungsvorrichtung beschichtet. Um diesen Vorgang zu starten, befestigen Sie zwei Streifen eines doppelseitigen Klebepads an der Unterseite einer Petrischale und halten Sie die Streifen zwei Zentimeter voneinander entfernt.

Lege einen Glasstab in die Mitte eines der Pads. Das Klebepad hält die Kapillaren an Ort und Stelle und der Glasstab stützt die vorbereiteten Kapillaren und verhindert, dass die Spitzen für die Kapillaren brechen. Verwendete Boris Silikatglaskapillaren mit einem Millimeter Außendurchmesser und 0,78 Millimeter im Durchmesser.

Führen Sie eine Kapillare in die Nadel ein, verklumpen Sie die Kapillare vorsichtig an Ort und Stelle und stellen Sie ihre Position so ein, dass sie in der Mitte des Heizfilaments liegt. Ziehen Sie die Klammern vorsichtig an, bis die Kapillaren an beiden Enden fest halten. Ziehen Sie die Kapillare mit dem hier gezeigten vordefinierten Programm.

Denken Sie jedoch daran, dass der Prozess der Programmierung des Abziehers ein Prozess von Versuch und Irrtum ist. Bis eine akzeptable Spitzenform erreicht ist, entstehen aus jeder gezogenen Kapillare zwei endgeformte Kapillaren. Entfernen Sie die gezogenen Kapillaren vom Instrument und untersuchen Sie die Spitzen, indem Sie verformte oder gebrochene Spitzen entsorgen.

Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Kapillaren in der Petrischale zu platzieren. Die Basis der Kapillaren, die an dem Klebepad befestigt sind, und der obere Teil lehnen sich mit einer Spitze nach oben an den Glasstab an. Ziehe weiter an den Kapillaren, bis die Petrischale voll ist.

Etwa 80 Kapillaren passen in eine Schale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Bestreichen Sie anschließend die Kapillaren mit Gold. Setze die Platte in den Gold-Sputter-Coter ein.

Achten Sie darauf, dass die Gaszufuhr gemäß den Herstellerangaben gewählt wird und aktivieren Sie einen vordefinierten Beschichtungszyklus. Die Beschichtung wird drei- bis sechsmal wiederholt, bis die Kapillaren gleichmäßig golden sind. Sobald die Kapillaren fertig sind, fahren Sie mit der Kalibrierung des Massenspektrometers fort.

Die meisten Experimente, die an MultiPro-Komplexen durchgeführt werden, werden mit einem solchen Elektrospray-Massenspektrometer mit vierfacher Flugzeit durchgeführt. Austritt aus Gewässern, der für hohe Massen modifiziert ist. Kalibrieren Sie vor dem Laden der Proteinprobe das Massenspektrometer mit Cäsiumiodid.

Bereiten Sie zunächst eine Cäsiumlösung von 100 Milligramm pro Milliliter in gereinigtem Wasser vor, Cäsium wird für die Kalibrierung hoher Massen verwendet. Da sich die einfach geladenen Salzcluster über einen weiten Massenbereich erstrecken, reicht das Verhältnis von 393 Mast zu Ladung bis weit über 10.000. Nehmen Sie mit einer stumpfen Pinzette eine beschichtete Kapillare aus der Petrischale und laden Sie zwei Mikroliter der Cäsiumlösung in die Kapillare.

Mit einer mit Einor-Gel beladenen Spitze. Schieben Sie die Lösung in Richtung der Kapillarspitze, entweder manuell oder mit einem Spin-Down-Adapter. Führen Sie die Kapillare in den Kapillarhalter ein und stellen Sie die Kapillare so ein, dass die Spitze etwa 10 Millimeter vom Rand des Halters entfernt ist.

Lege die Kapillare unter ein optisches Mikroskop und schneide die Spitze mit einer scharfen AA-Pinzette ab. Es ist wichtig zu überprüfen, ob sich keine Luftblasen in der Kapillare befinden, die den Durchfluss blockieren könnten, und dass die Kapillare nicht verstopft ist. Achten Sie außerdem darauf, dass die Goldbeschichtung nicht von der Kapillare abgezogen wird.

Wenn ja, ersetzen Sie die Kapillare oder schneiden Sie die Spitze ab und entfernen Sie den unbeschichteten Abschnitt. Verbinden Sie anschließend den Kapillarhalter mit der nano flow ESI-Schnittstelle. Drehen Sie den XY- und Z-Tisch nach hinten, um eine Beschädigung der Kapillare zu vermeiden, und schieben Sie den Tisch in seine aktivierte Position.

Die Kapillare sollte in einem Abstand von ein bis 10 Millimetern von der Konusöffnung platziert werden. Legen Sie Kapillarspannung und einen niedrigen Nano-Durchflussdruck an, bis das Sprühen eingeleitet wird. Versuchen Sie dann, den Nano-Strömungsdruck auf einen minimalen Wert zu reduzieren.

Optimieren Sie die Signalintensität, indem Sie die Position des XYZ-Tisches, die Kapillarspannung, den Nanoströmungsdruck und den Dissolvationsgasfluss anpassen. Um einen breiten Massenbereich von saisonalen Spitzenreihen zu erfassen, sollten die Beschleunigungsspannungen optimiert werden. Die hier verwendeten Parameter sind Kapillaren von 1,3 bis 1,7 Kilovolt, Probenkegel von 80 bis 150 Volt, ein Extraktionskegel, ein bis drei Volt zur Optimierung der Übertragung von Ionen mit hoher Masse, die schonende Entsalzungsbedingungen erfordern.

In der Anfangsvakuumstufe zwischen Quelle und Analysator wird der Vordruck auf fünf bis sechs Millibar erhöht. Um den Vordruck zu erhöhen, reduzieren Sie vorsichtig die Leitfähigkeit der Quellvakuumleitung zur Scrollpumpe, indem Sie das Absperrventil teilweise schließen, während Sie die Auswirkungen auf die Signalintensität überwachen. Wenn die Einrichtung der Massenspektrometer abgeschlossen ist, sammeln Sie etwa 30 Scans mit einem Scan pro Sekunde bei einem Master-Charge-Verhältnis-Bereich zwischen 1000 und 15.000 nach der Erfassung, kalibrieren Sie die Flugzeit anhand der entsprechenden Kalibriertabelle.

Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, kann die Proteinprobe geladen werden. Die Probe wird vor der Kalibrierung des Massenspektrometers vorbereitet, es sind niedrige mikromolare Konzentrationen erforderlich. Falls erforderlich, konzentrieren Sie die Probe mit Zentrifugal-Ultrafiltrationsgeräten.

Stellen Sie vor der Verwendung sicher, dass der Proteinkomplex nicht von der Gerätemembran absorbiert wird. Durch die Überprüfung des Volumens und der UV-Absorption dürfen nur flüchtige Lösungen für NESI verwendet werden, was oft einen Puffertausch erforderlich macht. Eine Mikrozentrifugen-Gelfiltrationssäule kann verwendet werden, um alle Spuren von Salzen, Puffermolekülen oder anderen nichtflüchtigen Addukten zu entfernen.

Unterbrechen Sie stattdessen die Probe. Eine wässrige Ammoniumacetatlösung. Dieser kritische Schritt bestimmt die Qualität der Spektren.

Wiederholen Sie den Pufferwechsel bis zu dreimal mit minimaler Verdünnung, weniger als einem Faktor von 1,3 pro Gerät, bis der maximale Austausch erreicht ist. Wenn sowohl Konzentrations- als auch Pufferwechsel erforderlich sind, können diese zusammen mit der zentrifugalen Ultrafiltration erfolgen, wie gerade am Anfang dieses Abschnitts gezeigt. Laden Sie anschließend die Probe wie für die Cäsiumiodid-Kalibrierung gezeigt und starten Sie das Sprühen.

Beginnen Sie mit der anfänglichen Optimierung des Sprays, bis das Signal erkannt wird. Verwenden Sie die gezeigte Gleichung für den durchschnittlichen Ladungszustand, in der M die Masse des Komplexes ist. Bei Daltons ist die genaue Position der Ladungszustände jedoch proteinabhängig.

Um eine komplexe Dissoziation zu verhindern, erhitzen Sie die Eisenquelle nicht. Schalten Sie die Heizung entweder aus oder halten Sie die Temperatur unter 40 Grad Celsius. Variieren Sie die Kapillarposition, den Probenkegel und die Extraktorspannungen.

Um die Eisenübertragung zu maximieren, ist ein möglicher Ausgangspunkt die Konusspannung, der Ausziehkegel 100 Volt, ein Volt und die Kapillarspannung 1,5 Kilovolt. Überprüfen Sie die resultierende Änderung in den Spektren. Optimieren Sie diese Parameter in Kombination mit einem Nano-Strömungsdruck, um die Vergötterung zu verbessern und Restwasser und Pufferkomponenten zu entfernen.

Erhöhen Sie die Vorspannung im Gasdruck in der Kollisionszelle. Typische Bias-Spannungen liegen im Bereich von 10 bis 100 Volt mit einem Trap-Gasfluss von einem bis 10 Millilitern pro Minute. Führen Sie dies sorgfältig durch, um eine Assoziation des Komplexes zu verhindern, passen Sie die Falle an und übertragen Sie die Kollisionsenergien.

Oft werden höhere Spannungen, meist im Bereich von 10 bis 30 Volt, für die Übertragung von Ionen mit hoher Masse benötigt. An dieser Stelle ist es wichtig, eine kollisionsinduzierte Dissoziation des Komplexes zu vermeiden, wie hier gezeigt. Nachdem ein stabiles Signal erreicht ist, hat es empfohlen, den Nano-Durchflussdruck und die Kapillarspannung auf minimale Werte zu senken, während ein stabiler Sprühnebel erhalten bleibt.

Nachdem Sie mehrere Scans gesammelt haben, fahren Sie mit der Identifizierung der Komponenten des Komplexes durch Tandem-Massenspektrometrie fort. Sobald ein optimales und stabiles Signal für den Proteinkomplex erhalten wurde, wählen Sie ein Vorläuferion aus, stellen Sie den Massenschwerpunkt in Isolationsbreite ein. Im Allgemeinen verwenden eine niedrige Massenauflösung von 12 und eine hohe Massenauflösung zwischen 13 und 15 einen weiten Massenbereich, um die Dissoziationsprodukte mit hoher Masse und niedriger Ladung zu detektieren und dann auf die gewünschten Werte zu reduzieren, um ms durchzuführen.

MS dissoziieren den Vorläufer Eisen Durch Erhöhung der Kollisionsenergie, abgekürzt CE, und des Drucks auf die Kollisionszelle wird entweder die Falle oder der Transfer von CE allmählich in Schritten von 10 bis 20 Volt erhöht und der Kollisionsgasdruck auf null bis fünf Milliliter pro Minute erhöht. Überwachen Sie Änderungen in den Spektren, bis optimale Aktivierungsbedingungen erreicht sind. Eine hohe Aktivierungsenergie kann die Dissoziation einer oder mehrerer Untereinheiten vom intakten Komplex induzieren und die Interaktionsaffinitäten verschiedener Untereinheiten klären.

Wählen Sie mehr als eine Charge für die ms MS-Analyse aus. Im Falle von überlappenden Komponenten hilft die Anschaffung eines Satzes von Tandem-MS-Spektren bei der Auflösung der Ladungsreihen der verschiedenen Populationen. Darüber hinaus dissoziieren höhere Ladungszustände leichter als niedrigere Ladungszustände, die MS und ms überlagern.

Ms-Spektren zur Validierung der Isolierung des gewählten Vorläuferions. Neben der Charakterisierung des intakten Komplexes durch MS und ms erzeugt MS unter milden denaturierenden Bedingungen kleinere Unterkomplexe und Lösungen und charakterisiert diese ebenfalls.

Die MS- und MS-MS-Analyse von Unterkomplexen bildet die Grundlage für die Definition der Untereinheitenarchitektur des Komplexes für die teilweise Aufdeckung der Wechselwirkungen der Untereinheiten, die allmähliche Zugabe von organischen Lösungsmitteln bis zu einer Konzentration von 50 % oder die Änderung des pH-Werts der Lösung durch Zugabe von Ammoniak oder Ameisensäure bis zu einer Konzentration von 4 %Schließlich, Um die Massen der einzelnen Untereinheiten zu bestimmen, aus denen der Komplex besteht, ist es wichtig, das Spektrum unter denaturierenden Bedingungen zu erfassen. Dies kann unter Verwendung der Zip-Spitze C vier mit einem Ace-Nitril-Verhältnis von 25 bis 75 mit 1 % Ameisensäure als elucianischem Lösungsmittel durchgeführt werden, wobei alle gesammelten Daten die Ergebnisse wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben durchgeführt und analysiert werden können. Vor dem Laden der Proteinkomplexprobe kalibrierten die Massenspektrometer mit Cäsiumiodid.

Die Reihe der gleichmäßig verteilten, rot markierten Peaks erstreckt sich über einen weiten Bereich von einem Master-Charge-Verhältnis von 393 bis weit über 10.000. Sie sind den einzeln geladenen Salzclustern der allgemeinen Zusammensetzung des Cäsium-plus-Komplexes zugeordnet. Zusätzliche Signale zwischen den schwarz markierten Hauptpeaks werden durch Doppel- und Dreifachladungsspezies der Reihe Cäsium zwei plus Komplex und Cäsium drei plus Komplex verursacht.

Die Erhöhung des Drucks in der Anfangsvakuumstufe ist für die Detektion der Cluster mit hoher Masse unerlässlich. Der Einfluss des Drucks auf die hohen Massenpeaks wird hier mit Druckrückmeldungen von 1,2 und 5,3 Millibar demonstriert. Das Massenspektrum für den höheren Druck ist hier erweitert dargestellt.

Hier ist ein Beispiel für die Massenspektrometrie eines Lektinvariantenkomplexes, der zu einer Ladungszustandsverteilung zwischen 3000 und 5.000 Hauptladungsverhältnis führt. Aufgrund einer adäquaten Desal der Ionen sind die Peaks jedoch breit. Die Erhöhung der Vorspannung von vier Volt auf 15 Volt, was zu einer Erhöhung der Beschleunigungsbedingungen führt, bewirkt das Abstreifen von Restwasser und Pufferkomponenten, wodurch ein hochaufgelöstes Spektrum entsteht, die gemessene Masse entspricht einem pentameren Komplex.

Der plus 15 Ladungszustand wurde dann für die Tandem-MS-Analyse ausgewählt. Die Erhöhung der Kollisionsenergie bewirkt die Freisetzung eines hochgeladenen Monomers, das bei einem Hauptladungsverhältnis von 1.664 zentriert ist, und eines abgestreiften tetrameren Komplexes im Bereich eines Massenladungsverhältnisses von 5.000 bis 8.000. Der Lektinvariantenkomplex wurde auch unter denaturierenden Bedingungen untersucht, was zu einer komplexen Assoziation führte.

Auf diese Weise kann die genaue Masse der einzelnen Untereinheiten, aus denen der Komplex besteht, bestimmt werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie MS- und Tandem-Ms-Spektren von Ionen mit hoher Masse erfassen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass Sie Ihre Probe richtig vorbereiten und nur flüchtige Puffer verwenden, die mit der Massenspektrometrie kompatibel sind.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.