Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, große Proteinassemblierungen mittels struktureller Massenspektrometrie zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem vergoldete Kapillaren für die Nano-Fluss-Elektrospray-Ionisation vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird die Probe vorbereitet und das Massenspektrometer für Messungen hoher Massen kalibriert.

Anschließend werden die experimentellen Bedingungen optimiert, um die Protein-Komplexe in der Gasphase intakt zu halten. Danach werden MS- und Tandem-MS-Spektren aufgezeichnet. Die MS-Spektren zeigten Ladungszustände, die in ihrer Masse dem intakten Komplex entsprachen, während Tandem-MS-Experimente das Assoziationsmuster von Monomeren und entkleideten Komplexen ergaben.

Hallo, ich bin Naam Kiba aus dem Labor von Miron am Whiteman-Institut für Wissenschaft, und ich bin Isaac Ky. Ich komme ebenfalls aus dem Labor von Michelon. Heute möchten wir Ihnen die grundlegende Vorgehensweise zur Analyse großer Protein-Komplexe mithilfe der strukturellen Massenspektrometrie zeigen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Protein-Komplexe hinsichtlich ihrer Stöchiometrie, Zusammensetzung und Wechselwirkungsnetzwerke zu charakterisieren. Beginnen wir also.

Die Analyse nichtstromführender gebundener Protein-Komplexe erfolgt mittels Air-Spray-Immunisierungstechnik unter Verwendung von Emme-Plus- oder Qua-Kapillaren. Diese Kapillare C kann zu einer feinen Spitze mit einem Durchmesser von etwa einem Mikrometer gezogen und anschließend mit einem leitfähigen Material wie Gold beschichtet werden. Solche Kapillaren sind kommerziell erhältlich, wie hier zu sehen ist.

Jedoch ist die Verwendung deutlich kostengünstiger. Die Glas-Kapillaren, äh, die gekühlt und beschichtet werden können, um sie gebrauchsfertig zu machen, werden auf diesem Nadel-Pooling-Gerät gekühlt und auf diesem äh Beschichtungsgerät beschichtet. Um dieses Verfahren zu beginnen, befestigen Sie zwei Streifen eines doppelseitigen Klebepads an der Unterseite einer Petrischale, wobei die Streifen zwei Zentimeter voneinander entfernt bleiben sollen.

Platzieren Sie einen Glasstab in der Mitte eines der Pads. Das Klebepad hält die Kapillaren an Ort und Stelle, und der Glasstab stützt die vorbereiteten Kapillaren und verhindert, dass die Spitzen der Kapillaren brechen. Verwenden Sie Boris-Silikatglas-Kapillaren mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,78 Millimeter.

Führen Sie eine Kapillare in die Nadel ein, fixieren Sie die Kapillare vorsichtig und justieren Sie ihre Position, sodass sie mittig im Heizfaden liegt. Ziehen Sie die Klemmen vorsichtig fest, bis die Kapillaren an beiden Enden sicher gehalten werden. Ziehen Sie die Kapillare mithilfe des hier gezeigten vordefinierten Programms.

Beachten Sie jedoch, dass der Prozess der Programmierung des Pullers auf Versuch und Irrtum beruht. Bis eine akzeptable Spitzenform erreicht ist, entstehen bei jedem Ziehvorgang zwei fertig geformte Kapillaren. Entfernen Sie die gezogenen Kapillaren vom Gerät und überprüfen Sie die Spitzen, wobei alle verformten oder gebrochenen Kapillaren verworfen werden müssen.

Verwenden Sie stumpfe Positionierpinzetten, um die Kapillaren in die Petrischale zu legen. Die Basis der Kapillaren ist an dem Klebepolster befestigt, und der obere Teil stützt sich an dem Glasstab ab, wobei die Spitze nach oben zeigt. Ziehen Sie weiter an den Kapillaren, bis die Petrischale voll ist.

In eine Petrischale mit 10 cm Durchmesser passen etwa 80 Kapillaren. Anschließend beschichten Sie die Kapillaren mit Gold. Führen Sie die Platte in den Gold-Sputter-Coter ein.

Stellen Sie sicher, dass die Gasversorgung gemäß den Anweisungen des Herstellers gewählt wird, und aktivieren Sie einen vordefinierten Beschichtungszyklus. Die Beschichtung wird drei bis sechs Mal wiederholt, bis die Kapillaren gleichmäßig golden sind. Sobald die Kapillaren bereit sind, kalibrieren Sie das Massenspektrometer.

Die meisten Experimente an MultiPro-Komplexen werden mit einem Elektrospray-Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometer wie diesem durchgeführt. Eingabe von Waters, das für hohe Massen modifiziert ist. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer vor dem Beladen der Proteinprobe mit Cäsiumiodid.

Zunächst stellen Sie eine Lösung mit 100 Milligramm pro Milliliter Caesium in gereinigtem Wasser her. Caesium wird zur Kalibrierung bei hoher Masse verwendet, da die einfach geladenen Salzcluster sich über einen weiten Massenbereich von 393 m/z bis weit über 10.000 erstrecken. Nehmen Sie mit stumpfen Pinzetten eine beschichtete Kapillare aus der Petrischale und füllen Sie zwei Mikroliter der Cäsiumlösung in die Kapillare.

Unter Verwendung einer Einweg-Gelbeladungsspitze. Die Lösung entlang der Kapillare zur Spitze schieben, entweder manuell oder mithilfe eines Abwärtsdreh-Adapters. Die Kapillare in den Kapillarhalter einführen und so ausrichten, dass die Spitze etwa 10 Millimeter vom Rand des Halters entfernt ist.

Platzieren Sie die Kapillare unter ein optisches Mikroskop und schneiden Sie die Spitze mit scharfen Pinzetten vom Typ AA ab. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen innerhalb der Kapillare befinden, die den Durchfluss blockieren könnten, und dass die Kapillare nicht verstopft ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Goldbeschichtung nicht von der Kapillare abgelöst wurde.

Falls ja, ersetzen Sie die Kapillare oder schneiden Sie die Spitze ab und entfernen Sie den unbeschichteten Bereich. Schließen Sie danach den Kapillarhalter an die Nano-Flow-ESI-Schnittstelle an. Drehen Sie den XY-, Z-Stage rückwärts, um Beschädigungen der Kapillare zu vermeiden, und schieben Sie den Stage in seine aktivierte Position.

Das Kapillarrohr sollte in einem Abstand von einem bis zehn Millimetern zur Konusöffnung platziert werden. Legen Sie eine Kapillarspannung und einen geringen Nanoflussdruck an, bis der Sprühvorgang beginnt. Anschließend versuchen Sie, den Nanoflussdruck auf einen minimalen Wert zu verringern.

Optimieren Sie die Signalintensität durch Anpassung der Position des XYZ-Stages, der Kapillarspannung, des Nanoflussdrucks und des Desolvationsgasflusses. Um ein breites Massenbereichsspektrum von Saison-Peak-Serien zu detektieren, sollten die Beschleunigungsspannungen optimiert werden. Die hier verwendeten Parameter sind eine Kapillarspannung von 1,3 bis 1,7 Kilovolt, eine Probekonusspannung von 80 bis 150 Volt und ein Extraktionskonusspannung von ein bis drei Volt, um die Transmission von hochmassigen Ionen zu optimieren, die milde Desal-Bedingungen erfordern.

Der Gegendruck wird im anfänglichen Vakuumstadium zwischen Quelle und Analysator auf fünf bis sechs Millibar erhöht. Um den Gegendruck zu erhöhen, verringern Sie vorsichtig die Leitfähigkeit der Vakuumleitung der Quelle zur Scrollpumpe, indem Sie das Absperrventil teilweise schließen, und beobachten Sie dabei den Einfluss auf die Signalamplitude. Stellen Sie nach der vollständigen Einrichtung des Massenspektrometers etwa 30 Scans bei einer Scanrate von einem Scan pro Sekunde im Master-Ladungsverhältnisbereich zwischen 1000 und 15.000 zusammen und kalibrieren Sie nach der Aufnahme die Flugzeit unter Verwendung der entsprechenden Kalibrierungstabelle.

Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, kann die Proteinprobe aufgetragen werden. Die Probe wird vor der Kalibrierung des Massenspektrometers vorbereitet, wofür niedrige mikromolare Konzentrationen erforderlich sind. Falls nötig, konzentrieren Sie die Probe mithilfe von Zentrifugal-Ultrafiltrationsgeräten.

Überprüfen Sie, ob der Protein-Komplex vor der Verwendung nicht an die Gerätemembran adsorbiert ist. Da nur flüchtige Lösungen für die NESI verwendet werden können, ist aufgrund der Überprüfung von Volumen und UV-Absorption oft ein Pufferaustausch erforderlich. Eine Mikrozentrifugen-Gel-Filtrationssäule kann verwendet werden, um Spuren von Salzen, Puffermolekülen oder anderen nichtflüchtigen Addukten vollständig zu entfernen.

Suspendieren Sie stattdessen die Probe in einer wässrigen Ammoniumacetatlösung. Dieser entscheidende Schritt bestimmt die Qualität der Spektren.

Wiederholen Sie den Pufferaustausch bis zu drei Mal mit minimaler Verdünnung, weniger als einem Faktor von 1,3 pro Gerät, bis der maximale Austausch erreicht ist. Falls sowohl eine Konzentrierung als auch ein Pufferaustausch erforderlich sind, können diese gemeinsam mithilfe der zentrifugalen Ultrafiltration durchgeführt werden, wie zuvor am Anfang dieses Abschnitts gezeigt. Laden Sie danach die Probe wie für die Kalibrierung mit Cäsiumiodid gezeigt auf und starten Sie das Sprühen.

Beginnen Sie mit der ersten Optimierung des Sprays, bis das Signal detektiert wird. Verwenden Sie die Gleichung für die durchschnittliche Ladungsstufe, wobei M die Masse des Komplexes ist. In Dalton hingegen hängt die genaue Position der Ladungszustände vom Protein ab.

Um die Dissoziation des Komplexes zu verhindern, darf die Eisenquelle nicht erhitzt werden. Schalten Sie daher entweder die Heizung aus oder halten Sie die Temperatur unter 40 Grad Celsius. Variieren Sie die Kapillarposition sowie die Spannungen an der Probenkonus- und Extraktorsonde.

Um die Eisenübertragung zu maximieren, ist ein möglicher Ausgangspunkt die Kegelspannung, 100 Volt Extraktorkegel, ein Volt und Kapillarspannung 1,5 Kilovolt. Überprüfen Sie die resultierende Änderung in den Spektren. Optimieren Sie diese Parameter in Kombination mit einem Nano-Fluss-Druck, um die Desolvatisierung zu verbessern und restliche Wasser- und Pufferbestandteile abzutrennen.

Erhöhen Sie die Vorspannungsspannung bei gleichzeitigem Anstieg des Gasdrucks in der Kollisionszelle. Typische Vorspannungsspannungen liegen im Bereich von 10 bis 100 Volt bei einem Fanggasfluss von ein bis zehn Milliliter pro Minute. Führen Sie dies sorgfältig durch, um eine Assoziation des Komplexes zu verhindern, und passen Sie die Kollisionsenergien im Fang und beim Transfer an.

Häufig sind höhere Spannungen, üblicherweise im Bereich von 10 bis 30 Volt, für die Übertragung von Ionen mit hoher Masse erforderlich. An dieser Stelle ist es wichtig, eine kollisionsinduzierte Dissoziation des Komplexes wie hier gezeigt zu vermeiden. Sobald ein stabiles Signal erreicht ist, wird empfohlen, den Nano-Flussdruck und die Kapillarspannung auf minimale Werte zu verringern, wobei ein stabiler Sprühvorgang aufrechterhalten werden muss.

Nach der Aufnahme mehrerer Scans fortfahren mit der Identifizierung der Bestandteile des Komplexes mittels Tandem-Massenspektrometrie. Sobald ein optimales und stabiles Signal für den Protein-Komplex erhalten wurde, ein Vorläuferion auswählen und das Massenzentrum in der Isolationsbreite einstellen. Im Allgemeinen eine niedrige Massenauflösung von 12 und eine hohe Massenauflösung zwischen 13 und 15 verwenden, um mit einem breiten Massenbereich die Dissoziationsprodukte mit hoher Masse und niedriger Ladung zu detektieren, und diesen anschließend auf die gewünschten Werte reduzieren, um die MS/MS-Analyse durchzuführen.

MS dissoziiert das Vorläufer-Eisen, indem die Kollisionsenergie (abgekürzt CE) und der Druck in der Kollisionszelle erhöht werden. Erhöhen Sie entweder die Trap- oder Transfer-CE schrittweise in 10- bis 20-Volt-Schritten und steigern Sie den Druck des Kollisionssgases auf null bis fünf Milliliter pro Minute. Überwachen Sie die Veränderungen in den Spektren, bis die optimalen Aktivierungsbedingungen erreicht sind. Eine hohe Aktivierungsenergie kann die Dissoziation einer oder mehrerer Untereinheiten aus dem intakten Komplex bewirken und so die Interaktionsaffinitäten verschiedener Untereinheiten verdeutlichen.

Wählen Sie mehr als eine Ladung für die MS/MS-Analyse aus. Im Falle überlappender Komponenten hilft die Aufnahme eines Satzes von Tandem-MS-Spektren bei der Auflösung der Ladungsreihen der verschiedenen Populationen. Darüber hinaus dissoziieren höhere Ladungszustände leichter als niedrigere Ladungszustände, was die Überlagerung von MS und MS/MS beeinflusst.

Ms-Spektren zur Überprüfung der Isolierung des gewählten Vorläuferions. Zusätzlich zur Charakterisierung des intakten Komplexes mittels MS und MS. MS erzeugt kleinere Teilkomplexe in Lösung unter milden denaturierenden Bedingungen, die ebenfalls charakterisiert werden.

Die MS- und ms-MS-Analyse von Subkomplexen bildet die Grundlage zur Bestimmung der Untereinheitsarchitektur des Komplexes. Um die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten schrittweise teilweise zu stören, werden organische Lösungsmittel bis zu einer Konzentration von 50 % hinzugefügt oder der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Ammoniak oder Ameisensäure bis zu einer Konzentration von 4 % verändert. Schließlich ist es zur Bestimmung der Massen der einzelnen Untereinheiten, aus denen der Komplex besteht, wichtig, das Spektrum unter denaturierenden Bedingungen aufzunehmen. Dies kann unter Verwendung einer Zip-Tip C18 mit einem Wasser-Acetonitril-Verhältnis von 25 zu 75 und 1 % Ameisensäure als Elutionslösung durchgeführt werden. Alle gesammelten Daten werden gemäß des beigefügten schriftlichen Protokolls verarbeitet und ausgewertet. Vor dem Auftragen der Protein-Komplexprobe wird das Massenspektrometer mit Cäsiumiodid kalibriert.

Die Serie gleichmäßig verteilter, rot markierter Peaks erstreckt sich über einen weiten Bereich von einem Hauptladungsverhältnis von 393 bis weit über 10.000. Sie werden einfach geladenen Salzclustern mit der allgemeinen Zusammensetzung des Caesium-plus-Komplexes zugeordnet. Zusätzliche Signale zwischen den Hauptpeaks, die in Schwarz markiert sind, resultieren aus doppelt und dreifach geladenen Spezies der Serie des Caesium-zwei-plus-Komplexes und des Caesium-drei-plus-Komplexes.

Die Erhöhung des Drucks in der anfänglichen Vakuumstufe ist entscheidend für die Detektion von Hochmassenclustern. Der Einfluss des Drucks auf die Hochmassensignale wird hier anhand von Druckanzeigewerten von 1,2 und 5,3 Millibar veranschaulicht. Das Massenspektrum für den höheren Druck ist hier vergrößert dargestellt.

Hier ist ein Beispiel für die Massenspektrometrie eines Lektin-Varianten-Komplexes, der eine Ladungszustandsverteilung zwischen 3000 und 5.000 m/z ergibt. Aufgrund einer unzureichenden Desalzierung der Ionen sind die Peaks jedoch verbreitert. Durch Erhöhung der Vorspannung von vier auf 15 Volt, was stärkere Beschleunigungsbedingungen bewirkt, werden restliche Wasser- und Pufferbestandteile abgespalten, wodurch ein hochaufgelöstes Spektrum entsteht; die gemessene Masse entspricht einem pentameren Komplex.

Der +15-Ladungszustand wurde anschließend für die tandem MS-Analyse ausgewählt. Die Erhöhung der Kollisionsenergie führt zur Freisetzung eines stark geladenen Monomers, das bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 1.664 zentriert ist, sowie eines entkleideten tetrameren Komplexes im Bereich von 5.000 bis 8.000 Masse-Ladungs-Verhältnis. Der Lectin-Varianten-Komplex wurde ebenfalls unter denaturierenden Bedingungen untersucht, die zur Komplexassoziation führen.

Auf diese Weise kann die genaue Masse der einzelnen Untereinheiten, aus denen der Komplex besteht, bestimmt werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man MS- und Tandem-Ms-Spektren von Ionen hoher Masse aufnimmt. Bei dieser Methode ist es wichtig, die Probe ordnungsgemäß vorzubereiten und nur flüchtige Puffer zu verwenden, die mit der Massenspektrometrie kompatibel sind.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.