Name: Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Analyse großer Proteinkomplexe mittels Struktur-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung makromolekularer Strukturen und liefert Einblicke in deren Zusammensetzung und Architektur.

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Die Autoren danken der Sharon Gruppenmitglieder für die kritische Durchsicht und für ihre Beiträge zu dem Manuskript. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Morasha und Bikura Programme, die Israel Science Foundation (Grant Nr. 1823-1807 und 378/08), das Josef Cohn Minerva Center for Biomembrane Research, die Chais Familie Fellows Program für New Scientists, die Abraham und Sonia Rochlin Stiftung, die Familie Wolfson Charitable Trust, die Helen und Milton A. Kimmelman Zentrums für Biomolekulare Struktur und Montage; dem Nachlass von Shlomo und Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, und Karen Siem, UK. Wir danken Dan Tawfik und Itamar Yadid, dass er uns das Lektin Variante Probe.

Teil 1: Herstellung von Gold-beschichteten Kapillaren für nanoflow Elektrosprayionisation Die Analyse der nicht-kovalenten Komplexen ist in der Regel durch nanoflow Elektrospray-Ionisation (NESI) 6 durchgeführt, unter Verwendung von Glas-oder Quarz-Kapillaren, die zu einer feinen Spitze (~ 1 um Innendurchmesser) und beschichtet mit leitfähigem Material gezogen wurden (meist Gold) . Solche Kapillaren sind aus kommerziellen Quellen erhältlich (New Objective oder Proxeon) ready-to-use, aber es kann kostengünstiger, sie im eigenen Haus vorbereitet: <ol><li> Stick zwei Streifen eines doppelseitigen Klebe-Pad auf der Unterseite einer Petrischale, 2 cm voneinander entfernt. Legen Sie einen Glasstab (8 cm x 5 mm) in der Mitte eines der Pads. Die Klebe-Pad wird die Kapillaren in Position zu halten, und der Glasstab wird die vorbereitete Kapillaren zu unterstützen, und halten die Spitzen zu brechen (Abb. 1). </li><li> Verwenden Sie Borosilikatglas Kapillaren, 1,0 mm OD x 0,78 mm ID (wir verwenden Packungen von 500 dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas Warner Instruments, cat. Nr. G100TF-4). Stecken Sie ein in die Nadel Abzieher (wir benutzen Modell P-97 aus der Sutter Instrument Co.) Kapillare. Klemmen Sie die Kapillare vorsichtig in Kraft, und stellen Sie ihre Position so, dass es in der Mitte der Nadel puller ist Heizdraht liegt. Ziehen Sie die Klemmen vorsichtig, bis die Kapillare gehalten Firma an beiden Enden. </li><li> Ziehen Sie die Kapillare mit einem vorgegebenen Programm. Jede Kapillare gezogen wird zu zwei letzten, geformt Kapillaren geben. Der Prozess der Programmierung der Abzieher ist eine Trial-and-error, bis eine akzeptable Form der Spitze erreicht ist. Wir verwenden das folgende Programm: <table border="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Wärme </td><td> Ziehen </td><td> Vell </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Entfernen Sie die gezogen Kapillaren aus dem Gerät und überprüfen Sie die Tipps, verwirft alle, die verformt oder gebrochen sind. Verwenden Sie stumpfen Pinzette (wir verwenden Bestückungspinzetten von CK Precision), um die Kapillaren in der Petrischale Platz. Die Basis der Kapillare sollte der Klebestreifen befestigt werden und der obere Teil sollte auf dem Glasstab schlank, mit der Spitze nach oben zeigt. </li><li> Sobald der Petrischale voll ist (etwa 80 Kapillaren passen in einen 10 cm-Durchmesser Teller), legen Sie die Platte in die Gold-Sputter-Coater (wir benutzen Modell-Nr. EMS550 von EMS). Stellen Sie sicher, dass die Gaszufuhr nach den Anweisungen des Herstellers gewählt wird, und aktivieren Sie eine vordefinierte Beschichtung Zyklus (wir verwenden Argon Druck 4 bar, bei einem Vakuum von 5 x 10 -2 mbar, einen Strom von 45mA und einer Beschichtung Zeit 1 min, für 3-6 Zyklen, bis die Kapillaren sind gleichmäßig golden). </li></ol> Teil 2: Probenvorbereitung <ol><li> Low mikromolaren Konzentrationen der Probe erforderlich sind (1 bis 20 uM). Wenn nötig, konzentrieren die Probe mittels Zentrifugalkraft Ultrafiltration Geräte (z. B. Vivaspin von Sartorius oder Nanosep von Pall Corporation). Es wird empfohlen, dass Sie die Adsorption der Protein-Komplex zu überprüfen, um das Gerät Membran, vor dem Gebrauch. </li><li> Oft sind die Aufreinigung Puffer oder Storage-Lösungen der Protein-Komplex nicht kompatibel mit NESI, für die nur flüchtige Lösungen verwendet werden können. Daher ist Pufferaustausch notwendig. Dieser entscheidende Schritt, in dem alle Spuren von Salzen, Puffer-Moleküle oder andere nicht-flüchtigen Addukte wie Glycerin, DTT oder EDTA entfernt werden, bestimmt die Qualität der Spektren. Normalerweise ist wässriger Ammoniumacetat-Lösung verwendet, bei einer Konzentration von zwischen 5 mm und 1 m, und bei 6-8 pH-Wert. Buffer Austausch kann mit einer Mikrozentrifuge Gelfiltrationssäule (zB Micro Bio-Spin 6 Chromatographiesäulen von Bio-Rad) werden. Dieser Schritt kann 1-3 mal mit minimaler Verdünnung (weniger als einen Faktor von 1,3 pro Gerät 5) wiederholt werden, bis maximal Austausch erreicht. Wenn beide Konzentration und Puffer Austausch erforderlich sind, kann diese zusammen durchgeführt werden, wobei Zentrifugalkraft Ultrafiltration (e, g, Vivaspin von Sartorius oder Nanosep von Pall Corporation). </li></ol> Teil 3: Kalibrierung des Massenspektrometers für hohe Masse-Messungen Die meisten der Experimente auf Multi-Protein-Komplexen durchgeführt werden unter Verwendung eines Nano-Elektrospray-Quadrupol-Time-of-flight (Q-TOF)-Instrument. Es wird empfohlen, dass Sie ein Quadrupolmassenfilter angepasst werden, um tiefe Frequenzen zu verwenden, um die Übertragung und die Masse Analyse von Ionen mit hoher m / z-Werte 7,8 zu ermöglichen. Es istauch empfohlen, dass Gaseinlässe 7,8 oder Hülsen 9, das Instrument in der ersten Ionenleitsystems hinzugefügt werden, um den Druck steuern bei der ersten Vakuum-Phase zu ermöglichen. Letzteres ermöglicht eine Optimierung des Getriebes, und Desolvatation von sehr großen Ionen 7-9. Derzeit sind kommerzielle ESI-TOF-und Q-ToF Instrumenten verschiedener Hersteller (z. B. Wasser, SCIEX, Bruker, oder Agilent), die relativ leicht und kostengünstig angepasst werden können, für die native MS-Anwendungen 7,8 zur Verfügung. Es ist jedoch möglich, Standard-ToF oder QTof Konfigurationen auf Instrumente wie die LCT oder QToF1 (Waters) verwenden, um Massenspektren der Komplexe bis zu 1 MDa zu erwerben, ohne die Notwendigkeit für Änderungen an der Hardware 5. Das Protokoll unten beschrieben wurde auf einem SYNAPT Instrument (Waters) durchgeführt. <ol><li> Es werden 100 mg / ml Lösung von CsI in gereinigtem Wasser. CsI ​​ist für hohe Masse Kalibrierung als einfach geladene Salz-Clustern (CsI) n Cs verwendet + erstrecken sich über einen weiten Massenbereich von 393 m / z auf deutlich über 10.000 (Abb. 2). </li><li> Mit stumpfen Pinzette, einen beschichteten Kapillare aus der Petrischale und laden 2μL der CsI-Lösung in die Kapillare mit Hilfe eines Eppendorf GELoader Spitze. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die Kapillarenhalter, und passen Sie die Kapillare in der Weise, dass die Spitze etwa 10 mm vom Rand entfernt von der Halterung befindet. </li><li> Schieben Sie die Lösung auf die Spitze der Kapillare entweder manuell oder mittels eines Spin-Down-Adapter. </li><li> Legen Sie die Kapillare unter einem optischen Mikroskop und schneiden Sie die Spitze, mit der scharfen AA-Pinzette. </li><li> Schließen Sie das Kapillarenhalter die nanoflow ES-Schnittstelle. Drehen Sie die XYZ-Bühne zurück, um eine Beschädigung der Kapillare und drücken Sie die Bühne in ihrer aktivierten Position. Die Kapillare sollte 1 platziert werden - 10 mm aus dem Konus Öffnung. </li><li> Bewerben Kapillar-Spannung (1050-1400 V) und geringer nanoflow Druck (0,00 bis 0,03 bar) bis spray eingeleitet wird, dann versuchen, die nanoflow Druck auf minimale Werte reduzieren. </li><li> Optimieren Sie die Signalintensität durch Verstellen der Position der XYZ-Bühne, die kapillare Spannung, die nanoflow Druck, und der zugeführten Gases fließen. </li><li> Zur Erkennung eines breiten Massenbereich von CsI Peakserie, sollte die beschleunigende Spannungen optimiert (wir verwenden die folgenden Parameter: Kapillare 1,3-1,7 kV, Probe Kegel 80-150V, Extraktion Kegel 1-3 V) werden. </li><li> Zur Optimierung der Übertragung von hohen Masse-Ionen, die sanfte Desolvatation Bedingungen, die Unterstützung Druck in der ersten Vakuum-Phase, zwischen der Quelle und der Analysator erforderlich, angehoben werden sollten. Dies kann durch eine sorgfältige Reduktion der Leitfähigkeit von der Quelle Vakuumleitung die Scroll-Pumpe, durch teilweises Schließen Sie das Absperrventil (SpeediValve) erreicht werden. Um den optimalen Punkt zu definieren, sollte letzteres getan, während die Überwachung der Wirkung auf die Signalintensität (verwenden wir im allgemeinen 3,0-6,5 mBar) werden. </li><li> Sammeln Sie ca. 30 Scans bei 1 Scan / sec, bei einem m / z Bereich zwischen 1.000 bis 15.000 m / z </li><li> Nach dem Erwerb, kalibrieren Sie die TOF mit der entsprechenden Kalibrier-Tabelle. </li></ol> Teil 4: MS-Analyse von intaktem Protein-Komplexen <ol><li> Legen Sie Ihre Probe, wie beschrieben (Teil 3, § § 2-5), und initiieren sprühen. </li><li> Beginnen Sie mit der ersten Optimierung der Spray (Teil 3, § § 6-9), bis das Signal erkannt wird. Die genaue Position der Ladung Staaten Protein-abhängige, aber es kann vorhergesagt werden, mit der Beziehung zwischen Ionen-Masse und mittlere Ladezustand, also: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), in denen m ist die Masse des Komplexes in Dalton. Um zu verhindern, komplexe Dissoziation, nicht Wärme der Ionenquelle: Entweder schalten die Heizung aus, oder halten Sie die Temperatur unter 40 ° C. </li><li> Variieren Sie die Kapillare Position Probe Kegel und Extraktor Spannungen Ionentransmission zu maximieren, und überprüfen Sie die daraus resultierende Veränderung in den Spektren. 1 V; Kapillar-Spannung 1,5 kV: Abzug Kegel; Ein möglicher Ansatzpunkt könnte Konusspannung 100 V sein. Optimieren Sie diesen Parameter in Kombination mit dem nanoflow Druck. </li><li> Zur Verbesserung Desolvatation und ausziehen Restwasser und Puffer-Komponenten, erhöhen Sie die Vorspannung und der Gasdruck in der Stoßzelle. Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, Dissoziation des Komplexes zu verhindern. Typische Bias-Spannungen liegen im Bereich von 10-100 V, mit einer Falle Gasfluss von 1-10 ml / min (Abb. 3). Die manuelle Einstellung der HF-Umgebung und Quadrupol-Profil verbessern kann die Übertragung von hohen Masse-Ionen. </li><li> Passen Sie Trap-und Transfer Kollisionsenergien. Oft sind höhere Spannungen für die Übertragung von hohen Masse-Ionen (in der Regel im Bereich von 10-30 V) erforderlich. An dieser Stelle ist es wichtig, Kollisions-induzierte Dissoziation des Komplexes zu vermeiden. </li><li> Nach ein stabiles Signal wird reached, empfiehlt es sich, dass die nanoflow Druck und Kapillar-Spannung auf minimale Werte reduziert werden, bei stabiler Spray. </li></ol> Teil 5: Tandem-Massenspektrometrie: distanziert Protein-Komplexe <ol><li> Sobald ein optimales und stabiles Signal erhalten worden ist, wählen Sie ein Vorläufer-Ion. Setzen Sie den Massenmittelpunkt und Isolation Breite (wir verwenden in der Regel eine LM Auflösung von 12 und eine HM Auflösung zwischen 13 und 15). Verwenden Sie einen weiten Massenbereich der hohen Masse / geringe Gebühr Dissoziation Produkte zu erkennen. Es wird empfohlen, dass Sie die m / z-Bereich eingerichtet, um die maximale Höhe, und dann reduzieren sie auf die gewünschten Werte. Wir empfehlen des weiteren die Überlagerung der MS und MS / MS-Spektren, um die Isolation des gewählten Precursor-Ionen zu validieren. </li><li> Um MS / MS, distanzieren Vorläufer-Ionen durch die Erhöhung der Aufprallenergie (CE) und der Druck auf die Kollision Zelle. Erhöhen Sie entweder Trap-oder Transfer-CE allmählich in Schritten von 10-20V, und hebt sie die Kollision Gasdruck auf 0-5 ml / min (gemeinsame Werte). Überwachen von Änderungen in den Spektren, bis eine optimale Aktivierung Bedingungen erreicht sind. Hohe Aktivierungsenergie kann induzieren die Dissoziation von einem oder mehreren Untereinheiten von der intakten komplex, und klären die Interaktion Affinitäten der verschiedenen Untereinheiten. Wir verwenden in der Regel Argon als Stoßgas in der Trap-/ Transfer-Zellen, obwohl Vorteile der Verwendung einer schwereren Gas (z. B. Xe oder SF 6) berichtet worden, jedoch sind diese Gase wesentlich teurer 11 (Abb. 3). </li><li> Es wird empfohlen, mehr als ein Ladezustand für MS / MS-Analyse ausgewählt werden. Im Fall von überlappenden Komponenten, wird den Erwerb einer Reihe von Tandem-MS-Spektren in Lösung die Ladung Reihe der verschiedenen Bevölkerungsgruppen zu unterstützen. Darüber hinaus werden höhere Ladezustände leichter distanzieren, im Vergleich zu niedrigeren Ladungszustand 12. </li><li> Neben der Charakterisierung der intakten Komplex, wird vorgeschlagen, dass kleinere Subkomplexe in Lösung generiert werden, unter milden denaturierenden Bedingungen. Die MS-und MS / MS-Analysen von Subkomplexe bilden die Grundlage für die Definition der Untereinheit Architektur des Komplexes 13. Für partielle Unterbrechung der Untereinheit-Untereinheit Interaktionen, allmählich fügen organischen Lösungsmitteln (zB Methanol, Isopropanol oder Acetonitril) bis zu einer Konzentration von 50%, oder ändern Sie den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Ammoniak oder Ameisensäure (bis zu einer Konzentration von 4 %). </li><li> Zur Bestimmung der Massen der einzelnen Untereinheiten, dass der Komplex bilden, ist es wichtig, ein Spektrum unter denaturierenden Bedingungen zu erwerben. Dies kann durchgeführt werden Zip-Tip C 4 (Millipore) mit einer 25:75 Wasser / Acetonitril-Verhältnis, mit 1% Ameisensäure als Elutionsmittel. </li></ol> Teil 6: Datenverarbeitung und-analyse <ol><li> Die Daten werden analysiert offline, mit einer spektralen Analyse-Programme für MS-Spektren. Wir benutzen normalerweise die MassLynx Programm (Waters). </li><li> Für Spektren, die eine breite m / z-Bereich umfassen, empfehlen wir, dass unterschiedliche Regelungen zur Glättung und Schwerpunkt-Parameter für den hohen und niedrigen m / z Regionen angewendet werden, um den Unterschied in Peak-Auflösung dieser Regionen Rechnung zu tragen. </li><li> So identifizieren Sie kostenlos Serie und berechnen Ladungszustände und Massen "zu finden Handbuch" die Funktion des MassLynx angewendet werden können. In Fällen von komplexen Massenspektren mit überlappenden Komponenten, kann die manuelle Berechnung der Massen einfacher sein. </li><li> Zur Erleichterung dieser Aufgabe werden, könnten sich zusätzliche Software verwendet werden, zum Beispiel: MaxEnt für Peakentfaltung 14. SOMMS für Peak Fitting und Simulation 15 und SUMMIT für die Zuordnung der Zusammensetzung und Stöchiometrie von Protein Subkomplexe und Erzeugung Protein-Interaktion Netze 13,16,17 . </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vorbereitung gold-beschichteten Nano-Elektrospray Kapillaren. A. Befestigen Sie zwei doppelseitigen Klebestreifen auf einer Petrischale, 2 cm voneinander entfernt. Zur Unterstützung der vorbereiteten Kapillaren, statt einem Glasstab (8 cm x 5 mm) in der Mitte eines der Pads. B. Kleben Sie das stumpfe Ende des vorbereiteten Kapillaren der Klebepad, und lehnen die Spitze auf dem Glasstab. C. Nach der Petrischale wird mit dem vorbereiteten Kapillaren, überziehen sie mit Gold gefüllt, bis eine dünne Schicht aus Gold gleichmäßig auf der äußeren Oberfläche der Kapillaren abgelagert. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Hochamt Kalibrierung mit Cäsium-Jodid-Ionen. Die großen und monisotopic Cluster von CsI haben es die Verbindung der Wahl für die Kalibrierung von Massenspektrometern für hohe Masse Analyse. Die Reihe der gleichen Abständen Gipfel über einen weiten Bereich erstrecken, von m / z 393 bis weit über 10.000. Sie sind Assigned zu einfach Salz-Cluster der allgemeinen Zusammensetzung (CsI) n Cs + berechnet. Zusätzliche Signale zwischen den großen Gipfeln werden durch Doppel-und Dreifach-geladenen Spezies der Serie entstanden sind; [(CsI) n Cs2] 2 + und [(CsI) n Cs3] 3 +, jeweils. Erhöhung des Drucks in der ersten Vakuum-Phase ist die Voraussetzung zur Erkennung der hohen Masse Cluster. Die Wirkung des Drucks auf die hohe Masse Gipfel wird in Panels A nachgewiesen. und B. mit Druck readbacks von 1,2 und 5,3 bzw.. C. Expansion des Massenspektrums bei B dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Nanoflow Elektrospray-Massenspektren einer pentameren Lektin. A. Die Massenspektrometrie eines Lektin-Variante komplexe (abgeleitet von lib1-B7 durch gerichtete Evolution 18) führt zu einem Ladezustand Verteilungen zwischen 3.000 und 5.000 m / z, jedoch aufgrund unzureichender Desolvatation der Ionen, sind die Spitzen breit. Vergleich von Panel A. und B. zeigen die Wirkung der Erhöhung der Bias-Spannung von 4V (A). Bis 15V (B.) Auf die Peakbreite. Dieser Anstieg der beschleunigenden Bedingungen wird das Strippen von Restwasser und Puffer-Komponenten, was zu einem hochaufgelösten Spektrum. Die gemessene Masse (60.240 ± 38 Da) entspricht einer pentameren komplex. C. die +15 Ladezustand damals für Tandem-MS-Analyse (grau schattiert in Panel B). D ausgewählt. Die Erhöhung der Stoßenergie verursacht die Freisetzung eines hoch geladenen Monomer, bei 1.664 m / z zentriert, und eine abgespeckte tetrameren Komplex, in dem Bereich von 5.000 - 8.000 m / z Alle Spektren wurden von einer Probe mit 20 uM Lösung in 0,5 M Ammoniumacetat erhalten.

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</ol>

Zum Erwerb hochwertiger Spektren Augenmerk sollte auf die Probenvorbereitung, die Konzentration der Probe und Puffer Austausch beinhalten gegeben werden. In verdünnten Proben ergeben ein Low-Signal, während hochkonzentrierte Proben kann ziemlich zähflüssig, und blockieren die Elektrospray Nadel. Darüber hinaus Lösung Additive wie Salze, Glycerin, Wasch-, Metall-Ionen und Reduktionsmittel (DTT oder β-Mercaptoethanol), neigen dazu, an der äußeren Oberfläche der Proteine ​​haften und verursachen Verbreiterung der Peaks. Deshalb, um gut aufgelöste Peaks zu erreichen, sollten diese Komponenten auf dem niedrigsten Konzentrationen möglich aufgenommen werden. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Position des nanoflow Kapillare, bezogen auf das Massenspektrometer Öffnung. Das Finden der &quot;sweet spot&quot; könnte eine Herausforderung sein für unerfahrene Benutzer, trotzdem sie beeinflusst maßgeblich die Qualität der Spektren. Es ist auch wichtig zu untersuchen, die nanoflow vor Beginn der Spraykapillare. Die Tröpfchengröße ist eine Funktion der Spitze Durchmesser, die ~ 1 &amp;mgr; werden soll. Kleine Tröpfchen für effizientere Ionisation führen und wäre daher von Vorteil sein. Es ist auch wichtig, um zu überprüfen, dass es keine Luftblasen in der Kapillare, die den Fluss versperren könnte, und dass die Gold-Beschichtung ist nicht aus der Kapillare während der Akquisition entkleidet und wenn ja, weiter schneiden Sie die Spitze. Beachten Sie, dass eine übermäßige Menge an Probe wird die Möglichkeit der Optimierung MS-Bedingungen wie die Kapillare Spannung, beschleunigenden Spannungen, Druck und Aufprallenergie zu erhöhen. Insgesamt haben sich die Verfahren in das Protokoll erklärt worden, um die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Architektur der zahlreichen Protein-Komplexe (siehe Bewertungen 2,3,4) zu bestimmen. Analyse großer MDa Komplexe wie das Ribosom 19 und hochgeordnete Viruskapside 20-22, in der Definition Substratbindung zu molekularen Maschinen 23-25, oder die Charakterisierung der Untereinheit Interaktion Netzwerke 26,17,16,17,27,28 dienen als aber ein paar Beispiele für den Mehrwert dieses Ansatzes.

Anforderungen an die Probe: <table border="1"><tr><td> Probe </td><td> Anforderung </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 1-2 ul </td><td> Per Kapillare </td></tr><tr><td> Konzentration </td><td> 1-20 um </td><td> Per komplexen </td></tr><tr><td> Puffer </td><td> Aquanos flüchtigen Puffer wie Ammoniumacetat bei pH = 6 bis 8 </td><td> In der Regel 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Reinigungsmittel </td><td> Minimal </td><td> Cluster von Wasch-Moleküle produzieren breite und Hauptpeaks </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimal (bis zu 5%) </td><td> Haftet unspezifisch an Proteine ​​und damit sind breite Peaks beobachtet </td></tr><tr><td> Organische Lösungsmittel </td><td> Bis zu 50% </td><td> Might Proteine ​​denaturieren Komplexe </td></tr><tr><td> Acids </td><td> Bis zu 4% </td><td> Denaturieren Protein-Komplexe </td></tr><tr><td> Salze </td><td> Minimal </td><td> Salzaddukte um eine breite und offene Gipfel führen </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimal </td><td> 1-2 um vorhanden sein können </td></tr><tr><td> Chelatbildner </td><td> Minimal </td><td> Über 250 um umfangreiche Adduktbildung führen </td></tr></table>

analyse großer proteinkomplexe von structural-massenspektrometrie

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Lebende Zellen steuern und regeln ihre biologische Prozesse durch die koordinierte Aktion von einer großen Anzahl von Proteinen, die sich versammeln in ein Array von dynamischen, multi-Protein-Komplexe 1. Um ein mechanistische Verständnis der verschiedenen zellulären Prozessen, ist es wichtig, die Struktur eines solchen Protein-Komplexe zu bestimmen, und zeigen, wie ihre strukturelle Organisation ihre Funktion bestimmt. Viele Aspekte der Multi-Protein-Komplexe sind jedoch schwer zu charakterisieren, die aufgrund ihrer heterogenen Natur, asymmetrische Struktur und Dynamik. Daher sind neue Ansätze für die Erforschung der tertiären Protein Organisation erforderlich. Einer der aufstrebenden Strukturbiologie Werkzeuge zur Analyse von makromolekularen Komplexen ist die Massenspektrometrie (MS) 2-5. Diese Methode liefert Informationen über die komplexen Protein-Zusammensetzung, Untereinheit Stöchiometrie und strukturelle Topologie. Die Macht der MS ergibt sich aus seiner hohen Empfindlichkeit und, als Folge, geringe Probenvolumina nötig, die Untersuchung von Protein-Komplexen an endogenen Ebenen zum Ausdruck ermöglicht. Ein weiterer Vorteil ist die Geschwindigkeit der Analyse, die Überwachung von Reaktionen ermöglicht in Echtzeit. Darüber hinaus kann die Technik die gleichzeitige Messung der Eigenschaften der getrennten Populationen koexistierenden in einer Mischung. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Struktur-MS zur Analyse von großen Protein-Baugruppen. Das Verfahren beginnt mit der Herstellung von Gold-beschichteten Kapillaren für nanoflow Elektrospray-Ionisation (NESI). Es fährt dann mit Probenvorbereitung, betont die Puffer-Bedingungen, die kompatibel sein NESI auf der einen Seite sollte und damit zu Komplexen intakt auf der anderen Seite zu halten. Wir haben dann zu erklären, Schritt-für-Schritt, wie man die experimentellen Bedingungen für die hohe Masse Messungen zu optimieren und zu erwerben MS und Tandem-MS-Spektren. Schließlich, ein Diagramm wir die Datenverarbeitung und-analysen, die folgen. Statt zu versuchen, jeden Aspekt des Protein-Baugruppen zu charakterisieren, stellt dieses Protokoll grundlegende MS-Verfahren, wodurch die Leistung der MS und MS / MS-Experimente auf nichtkovalente Komplexe. Insgesamt ist es unser Ziel, den Forschern auf dem Gebiet der strukturellen MS unbekannt, mit der Kenntnis der wichtigsten experimentellen Werkzeuge bieten.

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Lebende Zellen steuern und regulieren ihre biologischen Prozesse durch das koordinierte Zusammenwirken einer großen Anzahl von Proteinen, die sich zu einem ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, große Proteinassemblierungen mittels struktureller Massenspektrometrie zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem vergoldete Kapillaren für die Nano-Fluss-Elektrospray-Ionisation vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird die Probe vorbereitet und das Massenspektrometer für Messungen hoher Massen kalibriert.Anschließend werden die experimentellen Bedingungen optimiert, um die Protein-Komplexe in der Gasphase intakt zu halten. Danach werden MS- und Tandem-MS-Spektren aufgezeichnet. Die MS-Spektren zeigten Ladungszustände, die in ihrer Masse dem intakten Komplex entsprachen, während Tandem-MS-Experimente das Assoziationsmuster von Monomeren und entkleideten Komplexen ergaben.Hallo, ich bin Naam Kiba aus dem Labor von Miron am Whiteman-Institut für Wissenschaft, und ich bin Isaac Ky. Ich komme ebenfalls aus dem Labor von Michelon. Heute möchten wir Ihnen die grundlegende Vorgehensweise zur Analyse großer Protein-Komplexe mithilfe der strukturellen Massenspektrometrie zeigen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Protein-Komplexe hinsichtlich ihrer Stöchiometrie, Zusammensetzung und Wechselwirkungsnetzwerke zu charakterisieren. Beginnen wir also.Die Analyse nichtstromführender gebundener Protein-Komplexe erfolgt mittels Air-Spray-Immunisierungstechnik unter Verwendung von Emme-Plus- oder Qua-Kapillaren. Diese Kapillare C kann zu einer feinen Spitze mit einem Durchmesser von etwa einem Mikrometer gezogen und anschließend mit einem leitfähigen Material wie Gold beschichtet werden. Solche Kapillaren sind kommerziell erhältlich, wie hier zu sehen ist.Jedoch ist die Verwendung deutlich kostengünstiger. Die Glas-Kapillaren, äh, die gekühlt und beschichtet werden können, um sie gebrauchsfertig zu machen, werden auf diesem Nadel-Pooling-Gerät gekühlt und auf diesem äh Beschichtungsgerät beschichtet. Um dieses Verfahren zu beginnen, befestigen Sie zwei Streifen eines doppelseitigen Klebepads an der Unterseite einer Petrischale, wobei die Streifen zwei Zentimeter voneinander entfernt bleiben sollen.Platzieren Sie einen Glasstab in der Mitte eines der Pads. Das Klebepad hält die Kapillaren an Ort und Stelle, und der Glasstab stützt die vorbereiteten Kapillaren und verhindert, dass die Spitzen der Kapillaren brechen. Verwenden Sie Boris-Silikatglas-Kapillaren mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,78 Millimeter.Führen Sie eine Kapillare in die Nadel ein, fixieren Sie die Kapillare vorsichtig und justieren Sie ihre Position, sodass sie mittig im Heizfaden liegt. Ziehen Sie die Klemmen vorsichtig fest, bis die Kapillaren an beiden Enden sicher gehalten werden. Ziehen Sie die Kapillare mithilfe des hier gezeigten vordefinierten Programms.Beachten Sie jedoch, dass der Prozess der Programmierung des Pullers auf Versuch und Irrtum beruht. Bis eine akzeptable Spitzenform erreicht ist, entstehen bei jedem Ziehvorgang zwei fertig geformte Kapillaren. Entfernen Sie die gezogenen Kapillaren vom Gerät und überprüfen Sie die Spitzen, wobei alle verformten oder gebrochenen Kapillaren verworfen werden müssen.Verwenden Sie stumpfe Positionierpinzetten, um die Kapillaren in die Petrischale zu legen. Die Basis der Kapillaren ist an dem Klebepolster befestigt, und der obere Teil stützt sich an dem Glasstab ab, wobei die Spitze nach oben zeigt. Ziehen Sie weiter an den Kapillaren, bis die Petrischale voll ist.In eine Petrischale mit 10 cm Durchmesser passen etwa 80 Kapillaren. Anschließend beschichten Sie die Kapillaren mit Gold. Führen Sie die Platte in den Gold-Sputter-Coter ein.Stellen Sie sicher, dass die Gasversorgung gemäß den Anweisungen des Herstellers gewählt wird, und aktivieren Sie einen vordefinierten Beschichtungszyklus. Die Beschichtung wird drei bis sechs Mal wiederholt, bis die Kapillaren gleichmäßig golden sind. Sobald die Kapillaren bereit sind, kalibrieren Sie das Massenspektrometer.Die meisten Experimente an MultiPro-Komplexen werden mit einem Elektrospray-Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometer wie diesem durchgeführt. Eingabe von Waters, das für hohe Massen modifiziert ist. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer vor dem Beladen der Proteinprobe mit Cäsiumiodid.Zunächst stellen Sie eine Lösung mit 100 Milligramm pro Milliliter Caesium in gereinigtem Wasser her. Caesium wird zur Kalibrierung bei hoher Masse verwendet, da die einfach geladenen Salzcluster sich über einen weiten Massenbereich von 393 m/z bis weit über 10.000 erstrecken. Nehmen Sie mit stumpfen Pinzetten eine beschichtete Kapillare aus der Petrischale und füllen Sie zwei Mikroliter der Cäsiumlösung in die Kapillare.Unter Verwendung einer Einweg-Gelbeladungsspitze. Die Lösung entlang der Kapillare zur Spitze schieben, entweder manuell oder mithilfe eines Abwärtsdreh-Adapters. Die Kapillare in den Kapillarhalter einführen und so ausrichten, dass die Spitze etwa 10 Millimeter vom Rand des Halters entfernt ist.Platzieren Sie die Kapillare unter ein optisches Mikroskop und schneiden Sie die Spitze mit scharfen Pinzetten vom Typ AA ab. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen innerhalb der Kapillare befinden, die den Durchfluss blockieren könnten, und dass die Kapillare nicht verstopft ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Goldbeschichtung nicht von der Kapillare abgelöst wurde.Falls ja, ersetzen Sie die Kapillare oder schneiden Sie die Spitze ab und entfernen Sie den unbeschichteten Bereich. Schließen Sie danach den Kapillarhalter an die Nano-Flow-ESI-Schnittstelle an. Drehen Sie den XY-, Z-Stage rückwärts, um Beschädigungen der Kapillare zu vermeiden, und schieben Sie den Stage in seine aktivierte Position.Das Kapillarrohr sollte in einem Abstand von einem bis zehn Millimetern zur Konusöffnung platziert werden. Legen Sie eine Kapillarspannung und einen geringen Nanoflussdruck an, bis der Sprühvorgang beginnt. Anschließend versuchen Sie, den Nanoflussdruck auf einen minimalen Wert zu verringern.Optimieren Sie die Signalintensität durch Anpassung der Position des XYZ-Stages, der Kapillarspannung, des Nanoflussdrucks und des Desolvationsgasflusses. Um ein breites Massenbereichsspektrum von Saison-Peak-Serien zu detektieren, sollten die Beschleunigungsspannungen optimiert werden. Die hier verwendeten Parameter sind eine Kapillarspannung von 1,3 bis 1,7 Kilovolt, eine Probekonusspannung von 80 bis 150 Volt und ein Extraktionskonusspannung von ein bis drei Volt, um die Transmission von hochmassigen Ionen zu optimieren, die milde Desal-Bedingungen erfordern.Der Gegendruck wird im anfänglichen Vakuumstadium zwischen Quelle und Analysator auf fünf bis sechs Millibar erhöht. Um den Gegendruck zu erhöhen, verringern Sie vorsichtig die Leitfähigkeit der Vakuumleitung der Quelle zur Scrollpumpe, indem Sie das Absperrventil teilweise schließen, und beobachten Sie dabei den Einfluss auf die Signalamplitude. Stellen Sie nach der vollständigen Einrichtung des Massenspektrometers etwa 30 Scans bei einer Scanrate von einem Scan pro Sekunde im Master-Ladungsverhältnisbereich zwischen 1000 und 15.000 zusammen und kalibrieren Sie nach der Aufnahme die Flugzeit unter Verwendung der entsprechenden Kalibrierungstabelle.Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, kann die Proteinprobe aufgetragen werden. Die Probe wird vor der Kalibrierung des Massenspektrometers vorbereitet, wofür niedrige mikromolare Konzentrationen erforderlich sind. Falls nötig, konzentrieren Sie die Probe mithilfe von Zentrifugal-Ultrafiltrationsgeräten.Überprüfen Sie, ob der Protein-Komplex vor der Verwendung nicht an die Gerätemembran adsorbiert ist. Da nur flüchtige Lösungen für die NESI verwendet werden können, ist aufgrund der Überprüfung von Volumen und UV-Absorption oft ein Pufferaustausch erforderlich. Eine Mikrozentrifugen-Gel-Filtrationssäule kann verwendet werden, um Spuren von Salzen, Puffermolekülen oder anderen nichtflüchtigen Addukten vollständig zu entfernen.Suspendieren Sie stattdessen die Probe in einer wässrigen Ammoniumacetatlösung. Dieser entscheidende Schritt bestimmt die Qualität der Spektren.Wiederholen Sie den Pufferaustausch bis zu drei Mal mit minimaler Verdünnung, weniger als einem Faktor von 1,3 pro Gerät, bis der maximale Austausch erreicht ist. Falls sowohl eine Konzentrierung als auch ein Pufferaustausch erforderlich sind, können diese gemeinsam mithilfe der zentrifugalen Ultrafiltration durchgeführt werden, wie zuvor am Anfang dieses Abschnitts gezeigt. Laden Sie danach die Probe wie für die Kalibrierung mit Cäsiumiodid gezeigt auf und starten Sie das Sprühen.Beginnen Sie mit der ersten Optimierung des Sprays, bis das Signal detektiert wird. Verwenden Sie die Gleichung für die durchschnittliche Ladungsstufe, wobei M die Masse des Komplexes ist. In Dalton hingegen hängt die genaue Position der Ladungszustände vom Protein ab.Um die Dissoziation des Komplexes zu verhindern, darf die Eisenquelle nicht erhitzt werden. Schalten Sie daher entweder die Heizung aus oder halten Sie die Temperatur unter 40 Grad Celsius. Variieren Sie die Kapillarposition sowie die Spannungen an der Probenkonus- und Extraktorsonde.Um die Eisenübertragung zu maximieren, ist ein möglicher Ausgangspunkt die Kegelspannung, 100 Volt Extraktorkegel, ein Volt und Kapillarspannung 1,5 Kilovolt. Überprüfen Sie die resultierende Änderung in den Spektren. Optimieren Sie diese Parameter in Kombination mit einem Nano-Fluss-Druck, um die Desolvatisierung zu verbessern und restliche Wasser- und Pufferbestandteile abzutrennen.Erhöhen Sie die Vorspannungsspannung bei gleichzeitigem Anstieg des Gasdrucks in der Kollisionszelle. Typische Vorspannungsspannungen liegen im Bereich von 10 bis 100 Volt bei einem Fanggasfluss von ein bis zehn Milliliter pro Minute. Führen Sie dies sorgfältig durch, um eine Assoziation des Komplexes zu verhindern, und passen Sie die Kollisionsenergien im Fang und beim Transfer an.Häufig sind höhere Spannungen, üblicherweise im Bereich von 10 bis 30 Volt, für die Übertragung von Ionen mit hoher Masse erforderlich. An dieser Stelle ist es wichtig, eine kollisionsinduzierte Dissoziation des Komplexes wie hier gezeigt zu vermeiden. Sobald ein stabiles Signal erreicht ist, wird empfohlen, den Nano-Flussdruck und die Kapillarspannung auf minimale Werte zu verringern, wobei ein stabiler Sprühvorgang aufrechterhalten werden muss.Nach der Aufnahme mehrerer Scans fortfahren mit der Identifizierung der Bestandteile des Komplexes mittels Tandem-Massenspektrometrie. Sobald ein optimales und stabiles Signal für den Protein-Komplex erhalten wurde, ein Vorläuferion auswählen und das Massenzentrum in der Isolationsbreite einstellen. Im Allgemeinen eine niedrige Massenauflösung von 12 und eine hohe Massenauflösung zwischen 13 und 15 verwenden, um mit einem breiten Massenbereich die Dissoziationsprodukte mit hoher Masse und niedriger Ladung zu detektieren, und diesen anschließend auf die gewünschten Werte reduzieren, um die MS/MS-Analyse durchzuführen.MS dissoziiert das Vorläufer-Eisen, indem die Kollisionsenergie (abgekürzt CE) und der Druck in der Kollisionszelle erhöht werden. Erhöhen Sie entweder die Trap- oder Transfer-CE schrittweise in 10- bis 20-Volt-Schritten und steigern Sie den Druck des Kollisionssgases auf null bis fünf Milliliter pro Minute. Überwachen Sie die Veränderungen in den Spektren, bis die optimalen Aktivierungsbedingungen erreicht sind. Eine hohe Aktivierungsenergie kann die Dissoziation einer oder mehrerer Untereinheiten aus dem intakten Komplex bewirken und so die Interaktionsaffinitäten verschiedener Untereinheiten verdeutlichen.Wählen Sie mehr als eine Ladung für die MS/MS-Analyse aus. Im Falle überlappender Komponenten hilft die Aufnahme eines Satzes von Tandem-MS-Spektren bei der Auflösung der Ladungsreihen der verschiedenen Populationen. Darüber hinaus dissoziieren höhere Ladungszustände leichter als niedrigere Ladungszustände, was die Überlagerung von MS und MS/MS beeinflusst.Ms-Spektren zur Überprüfung der Isolierung des gewählten Vorläuferions. Zusätzlich zur Charakterisierung des intakten Komplexes mittels MS und MS. MS erzeugt kleinere Teilkomplexe in Lösung unter milden denaturierenden Bedingungen, die ebenfalls charakterisiert werden.Die MS- und ms-MS-Analyse von Subkomplexen bildet die Grundlage zur Bestimmung der Untereinheitsarchitektur des Komplexes. Um die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten schrittweise teilweise zu stören, werden organische Lösungsmittel bis zu einer Konzentration von 50 % hinzugefügt oder der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Ammoniak oder Ameisensäure bis zu einer Konzentration von 4 % verändert. Schließlich ist es zur Bestimmung der Massen der einzelnen Untereinheiten, aus denen der Komplex besteht, wichtig, das Spektrum unter denaturierenden Bedingungen aufzunehmen. Dies kann unter Verwendung einer Zip-Tip C18 mit einem Wasser-Acetonitril-Verhältnis von 25 zu 75 und 1 % Ameisensäure als Elutionslösung durchgeführt werden. Alle gesammelten Daten werden gemäß des beigefügten schriftlichen Protokolls verarbeitet und ausgewertet. Vor dem Auftragen der Protein-Komplexprobe wird das Massenspektrometer mit Cäsiumiodid kalibriert.Die Serie gleichmäßig verteilter, rot markierter Peaks erstreckt sich über einen weiten Bereich von einem Hauptladungsverhältnis von 393 bis weit über 10.000. Sie werden einfach geladenen Salzclustern mit der allgemeinen Zusammensetzung des Caesium-plus-Komplexes zugeordnet. Zusätzliche Signale zwischen den Hauptpeaks, die in Schwarz markiert sind, resultieren aus doppelt und dreifach geladenen Spezies der Serie des Caesium-zwei-plus-Komplexes und des Caesium-drei-plus-Komplexes.Die Erhöhung des Drucks in der anfänglichen Vakuumstufe ist entscheidend für die Detektion von Hochmassenclustern. Der Einfluss des Drucks auf die Hochmassensignale wird hier anhand von Druckanzeigewerten von 1,2 und 5,3 Millibar veranschaulicht. Das Massenspektrum für den höheren Druck ist hier vergrößert dargestellt.Hier ist ein Beispiel für die Massenspektrometrie eines Lektin-Varianten-Komplexes, der eine Ladungszustandsverteilung zwischen 3000 und 5.000 m/z ergibt. Aufgrund einer unzureichenden Desalzierung der Ionen sind die Peaks jedoch verbreitert. Durch Erhöhung der Vorspannung von vier auf 15 Volt, was stärkere Beschleunigungsbedingungen bewirkt, werden restliche Wasser- und Pufferbestandteile abgespalten, wodurch ein hochaufgelöstes Spektrum entsteht; die gemessene Masse entspricht einem pentameren Komplex.Der +15-Ladungszustand wurde anschließend für die tandem MS-Analyse ausgewählt. Die Erhöhung der Kollisionsenergie führt zur Freisetzung eines stark geladenen Monomers, das bei einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 1.664 zentriert ist, sowie eines entkleideten tetrameren Komplexes im Bereich von 5.000 bis 8.000 Masse-Ladungs-Verhältnis. Der Lectin-Varianten-Komplex wurde ebenfalls unter denaturierenden Bedingungen untersucht, die zur Komplexassoziation führen.Auf diese Weise kann die genaue Masse der einzelnen Untereinheiten, aus denen der Komplex besteht, bestimmt werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man MS- und Tandem-Ms-Spektren von Ionen hoher Masse aufnimmt. Bei dieser Methode ist es wichtig, die Probe ordnungsgemäß vorzubereiten und nur flüchtige Puffer zu verwenden, die mit der Massenspektrometrie kompatibel sind.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

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Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

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Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Erfahren Sie die Analyse großer Proteinkomplexe mittels Struktur-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung makromolekularer Strukturen und liefert Einblicke in deren Zusammensetzung und Architektur.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

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