Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

Hallo, ich bin Ian Ma vom Epigenomic Medicine Lab, der von Dr. Tom Caris am Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute geleitet wird. Ich mache gerade meine Doktorarbeit, die sich stark mit den Auswirkungen von Strahlung auf Gamma H two A X beschäftigt, dem molekularen Marker für Doppelstrangbrüche. Heute werde ich ein Experiment zur Quantifizierung von Gamma H zwei A expo als Reaktion auf Gammastrahlung auf menschlichen Kreta demonstrieren.

Dieses Immunfärbeprotokoll kann sowohl zur Überwachung der anfänglichen DNA-Schäden als auch zur DNA-Reparatur verwendet werden. Diese Methode ist auch nützlich, um die Wirksamkeit potenzieller strahlungsmodifizierender Verbindungen zu bewerten. Zum Beispiel führen Radiosensibilisatoren, von denen erwartet wird, dass sie DNA-Schäden erhöhen, zu einer höheren Anzahl von Gamma H zwei A x vier Seiten, während Radioprotektoren den gegenteiligen Effekt haben, da aufgrund einer Verringerung der DNA-Doppelstrangzöpfe eine geringere Anzahl von ForSight nachgewiesen wird.

Beginnen wir nun mit dem Experiment. Experiment. Bei den in diesem Experiment verwendeten Zellen handelt es sich um menschliche Zyten, die in Kammerobjektträgern mit 10.000 Zellen in jeder Vertiefung vorbereitet werden. Die Objektträger werden vor der Bestrahlung drei Tage lang bei 37 Grad in 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Schneiden Sie den 2D-Bestrahlungsgerät des Transporters auf Eis und bestrahlen Sie ihn dann mit zwei Grautönen, während die kontrollierten Objektträger unbestrahlt bleiben. Nachdem die Objektträger für eine Stunde in den Inkubator zurückgebracht wurden, ermöglicht uns diese Inkubationszeit, die anfänglichen DNA-Schäden zu betrachten. Als nächstes kommt die Färbung.

Media ist der erste, der die Brunnen sorgfältig baut, bevor 300 Mikroliter Calciumchlorid und magnesiumchloridfreies PBS in die Kammer gegeben werden. Um die Zellen zu spülen, schneiden Sie die linke Seite des Plattenschüttlers fünf Minuten lang in Scheiben, bevor der PBS vorsichtig herausgekippt wird. Die nächsten Zellen werden in hundert Mikrolitern 4%igem Paraldehyd fixiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen, bevor sie fünf Minuten lang in ein mit PBS gefülltes Coton-Glas auf dem Plattenschüttler gelegt werden.

Dieser Waschschritt wird wiederholt, um insgesamt drei fünfminütige Wäschen zu erhalten. Nach dem Waschen werden die Objektträger schonend auf saugfähigem Papier getrocknet. Um überschüssiges PBS zu entfernen, werden die Zellen dann in hundert Mikrolitern von 0,1 % premiumisiertVersuchen Sie die nächsten 100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur Nach 10 Minuten werden die Objektträger in PB S3 mal für jeweils fünf Minuten gewaschen, wie zuvor gezeigt.

Als nächstes wurden hundert Mikroliter 1%BSA in diese Vertiefung gegeben und 20 Minuten lang stehen gelassen, um die unspezifische Bindung zu blockieren. Nach dem Blockierungsschritt wird das BSA abgeschüttelt und hundert Mikroliter Primärantikörper, der sich aus einer Verdünnung von Anti-Phospho von eins zu 500 zusammensetzt. Gamma H zwei X Antikörper werden in jede Vertiefung gegeben.

Die Objektträger werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur belassen, gefolgt von drei fünfminütigen Wäschen in PBS. Überschüssiges PBS wird abgeschüttelt und hundert Mikroliter Sekundärantikörper, der aus einer Verdünnung von Alexa Boden 4 88 Gold Anti-Maus-IgG besteht, wird in eine Vertiefung gegeben und am Ende der Inkubation 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die Objektträger werden in PB S3 mal fünf Minuten lang gewaschen und mit Folie bedeckt, um ein Ausbleichen der Photoenergie zu verhindern. Hundert Mikroliter des nuklearen Flecks.

obere Reihe drei wird für 10 Minuten in die Mulde gelegt, gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen. Mit PBS sind die Kammern nun bereit, von der Rutsche genommen zu werden. Nehmen Sie die Kammern vorsichtig ab, indem Sie sie nach oben ziehen, und lösen Sie den Objektträger aus seiner Halterung.

Klopfen Sie überschüssige Feuchtigkeit ab und lassen Sie die Objektträger trocknen, bevor Sie einen Tropfen verlängertes Antifa-Reagenz aus Gold hinzufügen. Senken Sie ein Deckglas langsam auf die Rutsche ab und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Wischen Sie das Zugangsreagenz ab und lassen Sie die Scheibe eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Tragen Sie zum Schluss Nagellack an den Seiten des Deckglases auf, um es zu sichern, und lassen Sie die Objektträger über Nacht bei vier Grad im Dunkeln stehen. Ein konfokales Mikroskop wird verwendet, um die gebildete Gamma-H-Expo-Stelle sichtbar zu machen. Die Einstellungen werden angepasst, um ein scharfes Bild mit minimalem Hintergrundrauschen zu erhalten.

Bilder sind im Muster der Z-Serie mit einer Schrittweite von 0,5 Mikrometern erforderlich, um den Verlust von Brennpunkten in verschiedenen Ebenen des Zellkerns zu minimieren. Während der Analyse werden die einzelnen Ebenen entfaltet und gestapelt, um ein maximal projiziertes Bild zu erzeugen und die Überlappung der Brennpunkte zu minimieren. Um die Anzahl der erzeugten Brennpunkte zu quantifizieren, wird die Meta des Programms verwendet, jeder Kern wird mit den im Programm verfügbaren Werkzeugen hervorgehoben und jeder interessierende Bereich kann mit den gamma H zwei A X Brennpunkten auf das Bild übertragen werden.

Das Programm quantifiziert eine Anzahl von Brennpunkten in jeder Zelle, nachdem der Schwellenwert angewendet wurde, um alle Hintergründe auszuschließen, und die Informationen werden zur weiteren Analyse in einer Excel-Tabelle gespeichert. Und damit ist unser Immuneinstellungsprotokoll abgeschlossen, um die anfänglichen D-Schäden nach der Exposition gegenüber Kohlenstrahlung zu visualisieren. Dieser empfindliche Assay kann auch auf andere Aspekte der strahleninduzierten Schädigung mit doppelsträngigen Bremsen mit hoher Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit angewendet werden.

Danke fürs Zuschauen.I.