Name: Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von γH2AX-Foci nach ionisierender Strahlung in menschlichen Zellen mittels Immunfluoreszenz. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von DNA-Schäden und Reparaturmechanismen.

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Die Unterstützung des Australian Institute of Nuclear Science and Engineering anerkannt wird. TCK war der Empfänger der AINSE Auszeichnungen. Epigenomischen Medicine Lab wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (566559) unterstützt. LM wird von Melbourne Research (University of Melbourne) und Biomedical Imaging CRC zusätzliche Stipendien unterstützt. Die Unterstützung der Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody und Iska Carmichael) war von unschätzbarem Wert für diese Arbeit.

Cell Preparation <ol><li> Menschliche Keratinozyten (FEP-1811) wurden in Keratinozyten-Serum-freiem Medium gewachsen (K-SFM; Invitrogen), ergänzt mit epidermal growth factor-, Rinder-Hypophysen-Extrakt und 20 pg / ml Gentamicin, bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Eine einzelne Zelle Suspension wurde durch Ablösen mit Trypsin-EDTA (0,05% v / v) vorbereitet </li><li> Die Zellen wurden in 8-Well-Lab Tek II Mikrokammer Objektträger ausgesät (10.000 Zellen / well) und Dias wurden für 3 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert. </li></ol> Bestrahlung <ol><li> Die Zellen wurden auf Eis mit 2 Gy mit einer 137 Cs-Quelle (; Nordion International, ON, Canada; Gammacell 1000 Elite Strahler 20,6 Sekunden / Gy) bestrahlt </li><li> Unbestrahltes Steuerung und 2 Gy bestrahlten Zellen wurden für 1 Stunde bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert. </li></ol> Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Media wurde gekippt off und die Zellen wurden mit 300μl PBS (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) pro Vertiefung gewaschen und gedreht und auf eine orbitale Mischer für 5 Minuten. </li><li> Der Puffer wurde gekippt off und 100 &amp;mgr; l an frisch zubereiteten 4% (v / v) Paraformaldehyd in jede Vertiefung gegeben wurde und Objektträger wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Alle Inkubationen wurden in einem befeuchteten Färbetrog durchgeführt </li><li> Die Zellen wurden dann mit PBS (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) gewaschen. Objektträger wurden in einer Coplin Glas und gedreht und auf eine orbitale Mischer für 5 Minuten gesetzt. Dieser Waschschritt wurde noch zweimal wiederholt. </li><li> Der Puffer wurde gekippt off und überschüssiges PBS wurde vorsichtig abgetupft. </li><li> Die Zellen wurden permeabilisiert mit 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) pro Vertiefung und eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. </li><li> Die Zellen wurden mit PBS gewaschen (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben. </li><li> Nicht-spezifische Protein-Bindung wurde mit 100 ml BSA (1% v / v) pro Vertiefung und 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur blockiert. </li><li> Überschüssiges BSA wurde gekippt off und 100 &amp;mgr; l der primären monoklonalen Maus-anti-phospho Histon-H2AX Antikörper (1:500 verdünnt in 1% BSA; Millipore), wurde zu jeder Vertiefung für eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur zugegeben. </li><li> Die Zellen wurden mit PBS gewaschen (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) wie in den Schritten 3 und 4 oben beschrieben inkubiert und mit 100 &amp;mgr; l des sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG 1:500 verdünnt in 1% BSA ; Invitrogen) pro Well für 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. (Verwässert Antikörper wurde in der Dunkelheit während des gesamten Verfahrens aufbewahrt) </li><li> Die Zellen wurden mit PBS gewaschen (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben. Allerdings war Lichteinfall minimiert mit Folie. </li><li> Pro Well und eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur; Nuclear Gegenfärbung wurde mit 100ml TOPRO3 (Invitrogen verdünnt 1:500) durchgeführt </li><li> Die Zellen wurden mit PBS (w / o Ca 2 + oder Mg 2 +) gewaschen wie in Schritt 10 beschrieben. </li><li> Die Kammern wurden sorgfältig von den Folien entfernt, überschüssige Feuchtigkeit geblottet und Objektträger wurden an der Luft getrocknet. </li><li> Ein Tropfen ProLong GOLD Anti-Fade-Lösung (Invitrogen) wurde pro Vertiefung zugegeben und Objektträger wurden montiert (22X50 mm Deckglas) und überschüssige Flüssigkeit an den Rändern der Objektträger wurde ausgelöscht. </li><li> Die Folien wurden im Dunkeln für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur vor dem Versiegeln mit Lack gehalten. </li><li> Die Objektträger wurden über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln vor der Analyse. </li></ol> Mikroskopie / Analysis <ol><li> Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe verwendet, um Bilder mit dem Standard-GFP zu erwerben (für γH2AX - Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG) und weit roten Laser (für TOPRO-3). Typischerweise wird eine 63 x Ölimmersionsobjektiv verwendeten Objektiv. Die Bilder werden in einer Z-Serie Muster mit einer Schrittweite von 0,5 mu m erworben. Einer Schrittweite von 0,5 mu m wurde gewählt, um den Verlust von Herden in verschiedenen Ebenen zu minimieren, die Kerne. Während der Analyse werden die einzelnen Ebenen zerlegt und gestapelt, um eine maximale projizierte Bild, um die Überlappung der Herde (Top-Hat-Filter angewendet) zu minimieren produzieren. </li><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) wurde verwendet, um Zahl der Herde zu analysieren. Das Programm quantifiziert die Zahl der Herde in jeder Zelle nach dem Schwellenwert angewendet worden, um Kenntnisse und Schutzrechte ausschließen. Die Informationen werden in einer Microsoft Excel-Tabelle zur weiteren Analyse protokolliert. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Immunfluoreszenz Visualisierung von γH2AX Brennpunkte (grün) in unbehandelten humanen Keratinozyten und in Zellen mit 2 Gy bestrahlt und inkubiert noch 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. DNA wurde mit TOPRO-3 (blau) gefärbt. Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 510 Meta konfokale Mikroskop. Bar = 10 pm. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Immunfluoreszenz Visualisierung von γH2AX Brennpunkte (grün) in humanen Keratinozyten und in Zellen mit 2 Gy bestrahlt und inkubiert noch 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 510 Meta konfokale Mikroskop mit 0,5 um Z-Schnitte (1-9), um sicherzustellen, dass alle Schwerpunkte erworben wurden. Die Bilder wurde dann zur Quantifizierung mit Metamorph gestapelt. DNA wurde mit TOPRO-3 (blau) gefärbt. Die gestapelten γH2AX und blaue Bilder wurden für die Visualisierung gestapelt. Bar = 10 pm.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Nach Exposition gegenüber ionisierender Strahlung (γ-Strahlen), γH2AX Brennpunkte bilden sich rasch und Schwerpunkte Zahlen erreichen ein Maximum zwischen 30-60 Minuten 2. Daher spiegelt unsere 1 Stunde nach der Bestrahlung Zeitpunkt anfänglichen DSB Bildung. Wir haben die klinisch relevante Strahlendosis von 2 Gy für unser Experiment verwendet. Allerdings kann das Verfahren zur Strahlendosis eingesetzt werden bis zu 4 Gy für den Nachweis von anfänglichen DSB Bildung; erhebliche Überschneidungen der Herde aus...

<table><tbody><tr><td>Keratinozyten-Serumfreies Medium (K-SFM)</td><td>Medium</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Keratinozyten-Medium ergänzt mit humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor 1-53 (EGF 1-53) und Extrakt aus Rinderhypophyse (BPE).</td></tr><tr><td>Lab-Tek II Kammerobjektträger (8-Loch)</td><td>Kammerobjektträger</td><td>Nalge Nunc International</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (22x50 mm)</td><td>Deckgläser</td><td>Menzel-Gläser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1 %) wird verwendet, um unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Primäre und sekundäre Antikörper werden in BSA verdünnt.</td></tr><tr><td>PBS (ohne Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; und Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin-EDTA (0,05 %) wird verwendet, um Zellen von Kulturgefäßen zu lösen.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1 %) wird verwendet, um Zellen permeabilisieren.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyd (4 %) wird verwendet, um Zellen zu fixieren.</td></tr><tr><td>Maus-monoklonaler Antikörper gegen phospho-Histon-H2AX</td><td>Primärantikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Verdünnung des Primärantikörpers (1:500) in 1 % BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Verdünnung des Sekundärantikörpers (1:500) in 1 % BSA.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA-Färbemittel</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Gängiges DNA-Färbemittel: 4,6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI). Kann nur mit Mikroskopen mit geeignetem Anregungslaser verwendet werden.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Antifade-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Brechungsindex von 1,42 bei 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche mit belüftetem Verschluss</td><td>Kulturflasche</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (150x25 mm)</td><td>Petri-Schale</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Becher, Glas</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Färbebecken</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Bestrahler</td><td>Gammabestrahler</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Konfokal</td><td>Konfokalmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software zur Bildanalyse</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der γh2ax foci in response to ionisierender strahlung

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB), die entweder durch endogene Stoffwechselprozesse oder durch exogene Quellen hervorgerufen werden, sind eines der wichtigsten DNA-Schäden in Bezug auf das Überleben und die Erhaltung der genomischen Integrität. Eine frühe Reaktion auf die Induktion von DSB ist die Phosphorylierung des H2A Histon-Variante H2AX, bei der Serin-139-Rest, in der hoch konservierten C-terminalen SQEY Motiv bilden γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Nach Induktion von DSB ist H2AX schnell durch die Phosphatidyl-inosito-3-Kinase (PIKK) Familie von Proteinen, Ataxie Teleangiektasien mutiert (ATM), DNA-Protein-Kinase-katalytischen Untereinheit und ATM und Rad3 Zusammenhang phosphoryliert (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. In der Regel sind nur wenige Basenpaare (bp) in einer DSB beteiligt, gibt es jedoch erhebliche Signalverstärkung, angesichts der Bedeutung des Chromatin-Modifikationen in der DNA-Schäden Signalisierung und zu reparieren. Die Phosphorylierung von H2AX vermittelt überwiegend von ATM-Spreads zu den angrenzenden Gebieten von Chromatin, die bei etwa 0,03% des gesamten zellulären H2AX pro DSB<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Dies entspricht Phosphorylierung von etwa 2000 H2AX Moleküle Spanning ~ 2 Mbp Regionen des Chromatins um das Gelände des DSB und führt zur Bildung von diskreten γH2AX Herde, die leicht sichtbar gemacht und quantifiziert durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie kann<sup&gt; 2</sup&gt;. Der Verlust von γH2AX bei DSB spiegelt reparieren, jedoch gibt es einige Kontroversen darüber, was definiert komplette Reparatur von DSB, es wurde vorgeschlagen, dass Wiedereintritt der beiden DNA-Stränge ausreichend ist jedoch, wurde auch vorgeschlagen, dass Wiedereinsetzung des Original Chromatin Zustand der Verdichtung ist notwendig,<sup&gt; 4-8</sup&gt;. Das Verschwinden der γH2AX beinhaltet zumindest teilweise, Dephosphorylierung durch Phosphatasen, Phosphatase 2A und Phosphatase 4C<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Darüber hinaus hat die Entfernung des γH2AX durch Umverteilung mit Histon-Austausch mit H2A.Z verwickelt<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Wichtig ist, dass die quantitative Analyse der γH2AX Schwerpunkte, die eine breite Palette von Anwendungen in der Medizintechnik und der kerntechnischen Forschung geführt. Hier zeigen wir die am häufigsten verwendeten Immunfluoreszenz-Methode für die Bewertung der ersten DNA-Schäden durch den Nachweis und die Quantifizierung der γH2AX Brennpunkte in γ-bestrahlten adhärenten humanen Keratinozyten<sup&gt; 9</sup&gt;.

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), die entweder durch endogene metabolische Prozesse oder durch exogene Quellen induziert werden, stellen eine der kritischsten DNA-...

Hallo, ich bin Ian Ma aus dem Epigenomik-Medizin-Labor von Dr. Tom Caris am Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Derzeit absolviere ich meine Promotion, die sich stark mit den Auswirkungen von Strahlung auf Gamma H zwei A X beschäftigt, dem molekularen Marker für Doppelstrangbrüche. Heute werde ich ein Experiment zur Quantifizierung von Gamma H zwei A X als Reaktion auf Gammastrahlung in menschlichen Zellen demonstrieren.Dieses Immunfärbungsprotokoll kann verwendet werden, um sowohl den anfänglichen DNS-Schaden als auch die DNS-Reparatur zu überwachen. Diese Methode eignet sich außerdem zur Beurteilung der Wirksamkeit potenzieller strahlenverändernder Substanzen. Beispielsweise führen Radiosensibilisatoren, die einen erhöhten DNS-Schaden bewirken sollen, zu einer höheren Anzahl an Gamma-H2A.X-Foci, während Strahlenprotektoren den gegenteiligen Effekt zeigen, mit einer geringeren Anzahl detektierter Foci aufgrund einer Verringerung von DNS-Doppelstrangbrüchen.Beginnen wir nun mit dem Experiment. Die in diesem Experiment verwendeten Zellen sind humane Zellen, die in Kammerobjektträgern mit jeweils 10.000 Zellen pro Kammer vorbereitet wurden. Die Objektträger werden drei Tage v

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll präsentiert die Objektträgervorbereitung und das automatisierte Scoring des γ-H2AX-Foci-Assays an peripheren Blutlymphozyten. Um die Methode und Sensitivität des Assays zu veranschaulichen, wurden isolierte Lymphozyten in vitrobestrahlt. Diese automatisierte Methode des DNA-DSB-Nachweises ist nützlich für schnelle und biologische Dosimetrieanwendungen mit hohem Durchsatz.

Eine automatisierte mikroskopische Scoring-Methode für den γ-H2AX-Foci-Assay in humanen peripheren Blutlymphozyten

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Erfahren Sie die Quantifizierung von γH2AX-Foci nach ionisierender Strahlung in menschlichen Zellen mittels Immunfluoreszenz. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von DNA-Schäden und Reparaturmechanismen.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

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