In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Es ist von besonderer Bedeutung, das Interaktionsnetzwerk von Molekülen in lebenden Zellen aufzuklären, um die Mechanismen zu verstehen, die den Zellstoffwechsel und die Zellfunktion regulieren. Eine zunehmende Zahl von Methoden, die qualitative und quantitative Informationen liefern, treibt unsere Bemühungen voran, ganzheitliche Bilder der Zellfunktion zu erhalten. Co-IP-, TAP-Tag- oder Photo-Crosslinking-Assays ermöglichen die Aufreinigung von Prä-Molekülen in vitro.

Außerdem wurden verschiedene Ansätze zur Analyse von Proteinwechselwirkungen in lebenden Zellen entwickelt. Dazu gehören Hefe-Zwei-Hybrid-Screens oder Komplementationsassays mit fluoreszierenden Proteinen. Weiterhin wurden spektroskopische Methoden wie FRET oder FCS sowie nicht-spektroskopische Verfahren etabliert, um diese Frage zu untersuchen.

Die oben genannten Techniken wurden zur Aufzeichnung großer Zellpopulationen entwickelt, leiden jedoch darunter, dass sie eher indirekt sind und daher kaum quantitativ. Demgegenüber wurden einige hochwertige quantitative Ansätze eingeführt. Allerdings ist es schwierig, hohe Durchsatzleistung mit der Möglichkeit zu verbinden, quantitative Informationen zu gewinnen.

Wir haben kürzlich ein neues Konzept zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen entwickelt. Die Mikromusterungstechnik hier zeigt eine schematische Darstellung der mikromusterierten SA-Raster von BSA Sci fünf, die auf funktionalisierten Glasdeckeln aufgebracht werden, wobei die Zwischenräume mit Streptavidin gefüllt und anschließend mit biotinylierten Liganden versehen werden. In den meisten Fällen handelt es sich bei den Antikörpern gegen die Membran.

Protein-Köder in Zellen, die auf solchen Mikrobiom-Chips gezüchtet werden. Der Köder wird entsprechend dem Antikörper-Mikromuster in der Plasmamembran angeordnet. Interaktionen mit einem zweiten, fluoreszenzmarkierten Protein-Beuteobjekt werden durch Messung des Grades der Kopatterning untersucht, unter Verwendung eines Silikon-Master-PDMS-Stempels mit einem Array von Quadraten mit bestimmter Strukturgröße und -tiefe.

Die drei Mikrometer werden aus einem Gel hergestellt und ausgeschnitten. Die Stempel werden mit 100 % Ethanol und doppelt destilliertem Wasser gespült und anschließend mit Stickstoff getrocknet. Anschließend werden sie mit 0,67 Milligramm pro Milliliter Sci-Fi inkubiert.

Markierte BSA-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur während der Inkubation; epoxymodifizierte Glasdeckchen werden auf dieselbe Weise gereinigt. Auf dieselbe Weise werden die Stempel nach dem Einfärben mit PBS und Wasser gewaschen. Für BSA sci fünf Transfer.

Ein Stempel wird mit Stickstoff getrocknet und anschließend sofort unter Eigengewicht unter eine Glasdeckenscheibe für 30 Minuten gelegt. Die Position des Mikromusterfeldes wird auf der Rückseite der Deckenscheibe markiert. Nach dem Entfernen der Stempel werden die Deckenscheiben mit klebenden Silikonmasken versiegelt.

Die Kammern werden mit einer Streptavidin-Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter beladen, eine Stunde inkubiert und anschließend mit einem Milliliter PBS gespült. Danach werden die Streptavidin-Muster eine Stunde lang mit einer biotinylierten Antikörperlösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter inkubiert; nach dem Waschen mit PBS werden die Zellen in die Kammer gegeben. Sobald die Zellen an der Oberfläche angeheftet sind, ist die Probe bereit für die Messungen.

Die einzige Voraussetzung für die Auslesung ist ein Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, die Probe in Totalreflexionskonfiguration zu beleuchten. Solche Systeme sind kommerziell von verschiedenen Anbietern erhältlich und haben sich in den letzten Jahren für den Benutzer stark vereinfacht. Unser Detektionssystem ist an einem Epi-Fluoreszenzmikroskop aufgebaut.

Argon- und Krypton-Ionenlaser werden zur selektiven Fluoreszenzanregung der verwendeten Fluorophore genutzt. Die Proben werden in einer objektivbasierten Totalreflexionsanordnung mit einem hochaperturigen Ölimmersionsobjektiv mit 100-facher Vergrößerung beleuchtet. Nach geeigneter Filterung mithilfe standardmäßiger Filter-Sets wird die Fluoreszenz auf eine rückseitig belichtete CCD-Kamera abgebildet. Die Auslesung erfolgt im Zeitverzögerungs- und Integrationsmodus, wodurch das Scannen großer Probeflächen ermöglicht wird. Hierzu werden die Proben mithilfe eines motorisierten XY-Stages verschoben, der synchron mit der Zeilenverschiebung der Kamera arbeitet.

Der rückreflektierte Laserstrahl wird auf einer zweiteiligen Photodiode abgebildet, und das Differenzsignal wird zur Steuerung eines Z-Piezos für eine schnelle Nachfokussierung verwendet. Der Leser ist mit einem automatischen Fokus-Halte-System ausgestattet, das während des Scanvorgangs arbeitet, wobei ein Scan bei 488 Nanometer zur selektiven Anregung von GFP und ein zweiter Scan bei 647 Nanometer zur selektiven Anregung von PS Five erfolgt. Zur Datenanalyse verwenden wir ein in MATLAB geschriebenes Programm zur Kontrastberechnung, das auf der Fluoreszenzintensität innerhalb und außerhalb des erfassten Antikörperbereichs basiert.

Die Kontraststufe und damit der Grad der Proteininteraktion wird zur schnellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen untersucht. Auch kommerziell erhältliche automatisierte Software kann verwendet werden. Beispielsweise wurde die von Olympus angebotene scanR-Bildanalyse-Software erfolgreich für die Kontrastauswertung von Mikromusterversuchen getestet.

Wir analysieren die bekannte Interaktion von CD4 und LCK mit Proteinen in der frühen T-Zell-Signaltransduktion, wie hier gezeigt. Fluoreszierendes LCK verteilt sich eindeutig neu auf Bereichen, die mit CD4-Antikörpern beschichtet sind. Die Störung der Zink-Clasp-Struktur, die eine Hauptinteraktionsstelle dieser beiden Proteine darstellt, durch Zugabe eines Zink-Chelators verringert den Kontrast der LCK-Mikromuster.

Zusammenfassend sind die Hauptvorteile der Mikromustertechnik wie folgt: Quantifizierung lokaler, räumlich aufgelöster Proteinwechselwirkungen. Außerdem die Detektion schwacher Wechselwirkungen auch in der Plasmamembran lebender Zellen, die Nachweisung modulierter Bait-Prey-Wechselwirkungen, Analyse des Ruhezustands und die Anwendbarkeit des Ansatzes für Hochdurchsatzverfahren.