Name: In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Mikrostrukturierungstechnik zur quantitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Detektion schwacher Interaktionen und modulierter Bait-Prey-Beziehungen.

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Wir möchten Quentina Beatty, Universität Linz, Österreich, für ihre freundliche Hilfe, Katharina Strub, Universität Genf, Schweiz danken, für die hCD71-GFP-Konstrukt, und Daniel Legler, Universität Konstanz, der Schweiz, für die GPI-GFP -DAF zu konstruieren. Und die GEN-AU Projekt des österreichischen Bundesministeriums für Wissenschaft und Forschung; Diese Arbeit wurde vom FWF (Projekt Y250-B03 FWF) unterstützt.

Mikrokontaktdrucken: <ol><li> Cut out Bereich der Mikrostruktur des PDMS-Stempels mit einem Skalpell </li><li> Wash das Feld mit der Mikrostruktur durch Spülen mit Ethanol (100%) und destilliertem Wasser. </li><li> Trocknen Sie die PDMS-Stempel mit Stickstoff oder Argon. </li><li> Je 50 ul BSA-Cy5 Arbeit-Lösung (0,67 mg / ml) auf die PDMS-Stempel, so dass die gesamte Mikrostruktur Feld mit Lösung bedeckt ist. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Mikrostruktur Bereich durch Spülen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und destilliertem Wasser. </li><li> Trocknen Sie die PDMS mit Stickstoff oder Argon. </li><li> Legen Sie die PDMS-Stempel unter seinem eigenen Gewicht auf die Mitte einer Epoxy-beschichtete Deckglas und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in einer Petrischale. </li><li> Beschriften Sie die Position der PDMS-Stempel auf der Rückseite des Deckglases und Streifen der Stempel aus der Folie mit einer Pinzette. </li><li> Stick eine sichere Abdichtung Hybridisierung Kammer über die Mikrokontaktstruktur bedruckte Bereich auf dem Deckglas. Das Label hilft zu lokalisieren der Mitte des Feldes. </li><li> Pipette 60 ul Streptavidin Arbeit-Lösung (50 pg / ml) in die Reaktionskammer und inkubieren Sie die Probe für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBS, indem Sie die Puffer in einem Hafen der Kammer zu entfernen und gleichzeitig an den zweiten Port mit einer Pumpe. </li><li> Pipette 60 ul biotinylierten Antikörper Arbeit-Lösung (10 pg / ml in PBS mit 0,1% Tween 20 ergänzt, "PBST") in die Reaktionskammer und Inkubation für 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Probe mit 1 ml PBST und anschließend 1 ml PBS, indem Sie die Puffer in einem Hafen der Kammer und Entfernen wieder auf den zweiten Port mit einer Pumpe. </li><li> Bewahren Sie die mikrostrukturierten Oberflächen in PBS im Dunkeln bei Raumtemperatur, bis die Zellen bereit für die Aussaat sind. </li></ol> Die Inkubation von Zellen auf der mikrostrukturierten Oberfläche: <ol><li> Wachsen adhärente Zellen zu 50% Konfluenz in einer 3 cm Gewebekulturplatte. </li><li> Lösen Sie exprimieren Köder und Beute Proteine ​​von Interesse mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung und Zentrifuge 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand verwerfen und lösen das Zellpellet in dem entsprechenden Wachstumsmedium. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand verwerfen und lösen das Zellpellet in geeigneten Nährmedium. </li><li> Tauschen Sie die PBS aus der Reaktionskammer auf den mikrostrukturierten Deckglas von 60 ul der Zellsuspension. </li><li> Erstellen einer feuchten Kammer durch Einweichen eines sterilen Tupfer in destilliertem Wasser und legt es in die Petrischale, um die Probe vor Trockenlauf zu verhindern. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Atmosphäre auf den mikrostrukturierten Oberflächen. </li><li> Vor einer Analyse der Zellen unter dem Mikroskop, den Austausch des Mediums durch gepufferte Salz Hank s Lösung mit Ca 2 + und Mg 2 +. </li></ol> Mikroskopie: <ol><li> Das Deckglas wird auf einer geeigneten Halterung gelegt und die Zellmorphologie unter Weißlicht-geprüft. </li><li> Die Qualität der BSA-Cy5 Muster wird durch Anregung bei 647 nm überprüft. </li><li> Mikrostrukturen von fluoreszierenden Beute-Protein (GFP oder YFP) sind bei 488 oder 514 nm unter Total Internal Reflection (TIR) ​​Anregung aufgenommen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn es Wechselwirkungen zwischen den Target-Proteine ​​in den Zellen auf einer mikrostrukturierten Oberfläche gewachsen ist, wird die Beute folgen den Köder Umverteilung. Die resultierende Mikrostruktur können visualisiert werden, indem die Fluoreszenz-Markierung der Beute-Protein. Wichtig ist der Kontrast erhalten ein direktes Maß für die Stärke der Wechselwirkung (siehe Abbildung 1). Daher ist eine einfache Auswertung der Interaktion von zwei Proteinen möglich wird - ohne die Notwendigkeit einer weiteren Prozess der gemessenen Primärdaten. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Umlagerung des Köders in der lebenden Zelle Plasmamembran an unterschiedlichen Stärke der Wechselwirkung. TIR Bilder von T24-Zellen mit (a) CD71-GFP auf CD71-Antikörper, transfiziert, (b) CD4 und cytosolische YFP auf CD4-Antikörper und (c) GPI-GFP-DAF auf CD59-Antikörper microbiochips gezeigt. Die Daten sind charakteristisch für stark (a), no (b) oder schwache Wechselwirkung (c). (A) aus (Weghuber et al., In press), (b) aus (Schwarzenbacher et al., 2008) wiedergegeben.

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Das Video enthält Bilder, die von Olympus, von der Homepage des Visualization Research Lab entnommen, Brown University zur Verfügung gestellt wurden oder reproduziert aus (Kim et al., 2003).

Das dazugehörige Video zeigt ein Verfahren zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Im Prinzip kann jeder TIRF-basierte Mikroskopie-Plattform als Anzeige verwendet werden. Nur wenn eine hohe Empfindlichkeit gewünscht wird (zB für die Detektion einzelner Moleküle), werden fortgeschrittene Mikroskope verlangt werden. Um dies zu erreichen beste Ergebnisse die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsprozesses erfordern besondere Aufmerksamkeit: <ol class="lroman"><li> Shop Cy5-Stammlösung bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors und bereiten die BSA-Cy5 Arbeit Lösung frisch vor dem Mikrokontaktdrucken. </li><li> Achten Sie darauf, nicht auf die Mikrostruktur auf dem PDMS Kratzer mit der Pipettenspitze und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors. </li><li> Legen Sie das Deckglas auf einem sterilen Tupfer zu verhindern Verkleben der Glasscheibe auf die Petrischale. Sobald die PDMS-Stempel auf den Objektträger geklebt hat, bewegen Sie es nicht. </li><li> Vermeiden Sie Luftblasen in der Reaktionskammer und inkubieren Sie die Probe bei schlechten Lichtverhältnissen zu vermeiden Bleichen des Fluorophors. </li><li> Lassen Sie sich nicht die Probe trocken für mehr als 2 Minuten, um die Bildung von Salzkristallen zu vermeiden. </li><li> Für die Ablösung der Zellen nicht verwenden Trypsin als es Abspaltung der extrazellulären Domäne des bisher geäußert Membranproteinen. Vermeiden Trypsin wird hilfreich sein, die für Proteine ​​mit niedrigen Fluktuationsrate zu Mikrostrukturen unmittelbar nach Anheftung der Zellen auf der Oberfläche bilden. </li><li> Kontrollieren Sie die Anzahl der inkubierten Zellen im Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht erreichen mehr als 30-50% Konfluenz. Stellen Sie sicher, dass die übermäßige Zellen sofort sind auf die schnelle Befestigung von Zellen auf der Antikörper-beschichteten Oberfläche entfernt. </li><li> Nur Folien mit hoher Qualität BSA-Cy5 Muster können zur weiteren Analyse verwendet werden. </li><li> Stabile Expression des fluoreszierenden Proteins Beute ist vorzuziehen aufgrund der größeren Anzahl von Zellen, die pro Scan analysiert werden kann. </li><li> Angemessene TIRF Einstellung ist unerlässlich, um Muster durch cytosolische Hintergrund sichtbar zu machen. </li></ol> Die Mikro-Strukturierung Technik bietet mehrere Möglichkeiten für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Erstens, zusammen mit der Quantifizierung der lokalen, räumlich aufgelöster Protein-Protein-Interaktionen auch die Detektion von schwachen oder indirekten Wechselwirkungen ist, ohne den Nachteil, dass eine hohe Anzahl von falschen Positiven oder Negativen möglich. Zweitens ermöglicht die Forscher, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Plasmamembran von lebenden Zellen, die nur schwer durch biochemische Ansätze wie die 2-Hybrid-Screen zu erreichen, ist zu analysieren. Drittens der Ansatz ermöglicht die Erkennung von Köder-Beute-Interaktionen, moduliert durch Veränderungen der Umwelt wie die Temperatur, die Anwesenheit verschiedener Proteine ​​oder andere Moleküle oder post-translationale Modifikationen sind. So ist die Assay ermöglicht die Screening-Modulatoren einer bestimmten Interaktion Paar im Kontext der lebenden Zellen. Darüber hinaus, indem die Flächendichte der Erfassung Liganden oder die Verwendung von monovalenten Liganden, wird die Analyse der Ruhezustand möglich. Schließlich, wenn ausreichende Scan-Plattformen verwendet werden, ist die Zahl der analysierten Zellen hoch genug, um einen hohen Durchsatz Anforderungen der Pharma-Unternehmen für Wirkstoff-Screening (Ramm, 2005) überein.

in-vivo-detektion von protein-protein-interaktionen auf micro-gemusterten oberflächen

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Die Aufklärung der Interaktion Netzwerk von Molekülen<em&gt; In-vivo</em&gt; Ist der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die die Zellfunktion und den Stoffwechsel regulieren. Eine Vielzahl von methodischen Möglichkeiten für die Behandlung molekularer Wechselwirkungen in Zellen entwickelt worden, aber die meisten dieser Methoden leiden darunter, eher indirekt und daher kaum quantitativ. Im Gegenteil, ein paar High-End-quantitative Ansätze wurden eingeführt, die jedoch schwer zu hohen Durchsatz zu verlängern. So kombinieren hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren, haben wir kürzlich ein neues Konzept entwickelt für die Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Konzeption und den Bau dieses Systems, die für die Analyse von Interaktionen zwischen einem Fluorophor-markierten Protein (&quot;Beute&quot;) und ein Membranprotein ermöglicht (&quot;Köder&quot;)<em&gt; In-vivo</em&gt;. Die Zellen werden auf mikrostrukturierten Oberflächen mit Antikörpern gegen den Köder exoplasmic Domain-funktionalisierte überzogen. Bait-Beute-Interaktionen sind über die Neuverteilung der fluoreszierenden Beute untersucht. Das Verfahren ist durch eine hohe Empfindlichkeit bis auf die Ebene einzelner Moleküle, die Fähigkeit, schwache Wechselwirkungen zu erkennen und mit hohem Durchsatz Fähigkeit charakterisiert, so dass es für die Screening-Instrument.

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Die Entschlüsselung des Interaktionsnetzwerks von Molekülen in vivo ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die die Zellfunktion und den Stoffwechsel regulieren. Eine Vielzahl von ...

Es ist von besonderer Bedeutung, das Interaktionsnetzwerk von Molekülen in lebenden Zellen aufzuklären, um die Mechanismen zu verstehen, die den Zellstoffwechsel und die Zellfunktion regulieren. Eine zunehmende Zahl von Methoden, die qualitative und quantitative Informationen liefern, treibt unsere Bemühungen voran, ganzheitliche Bilder der Zellfunktion zu erhalten. Co-IP-, TAP-Tag- oder Photo-Crosslinking-Assays ermöglichen die Aufreinigung von Prä-Molekülen in vitro.Außerdem wurden verschiedene Ans&auml;tze zur Analyse von Proteinwechselwirkungen in lebenden Zellen entwickelt. Dazu geh&ouml;ren Hefe-Zwei-Hybrid-Screens oder Komplementationsassays mit fluoreszierenden Proteinen. Weiterhin wurden spektroskopische Methoden wie FRET oder FCS sowie nicht-spektroskopische Verfahren etabliert, um diese Frage zu untersuchen.Die oben genannten Techniken wurden zur Aufzeichnung großer Zellpopulationen entwickelt, leiden jedoch darunter, dass sie eher indirekt sind und daher kaum quantitativ. Demgegenüber wurden einige hochwertige quantitative Ansätze eingeführt. Allerdings ist es schwierig, hohe Durchsatzleistung mit der Möglichkeit zu verbinden, quantitative Informationen zu gewinnen.Wir haben kürzlich ein neues Konzept zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen entwickelt. Die Mikromusterungstechnik hier zeigt eine schematische Darstellung der mikromusterierten SA-Raster von BSA Sci fünf, die auf funktionalisierten Glasdeckeln aufgebracht werden, wobei die Zwischenräume mit Streptavidin gefüllt und anschließend mit biotinylierten Liganden versehen werden. In den meisten Fällen handelt es sich bei den Antikörpern gegen die Membran.Protein-Köder in Zellen, die auf solchen Mikrobiom-Chips gezüchtet werden. Der Köder wird entsprechend dem Antikörper-Mikromuster in der Plasmamembran angeordnet. Interaktionen mit einem zweiten, fluoreszenzmarkierten Protein-Beuteobjekt werden durch Messung des Grades der Kopatterning untersucht, unter Verwendung eines Silikon-Master-PDMS-Stempels mit einem Array von Quadraten mit bestimmter Strukturgröße und -tiefe.Die drei Mikrometer werden aus einem Gel hergestellt und ausgeschnitten. Die Stempel werden mit 100 % Ethanol und doppelt destilliertem Wasser gespült und anschließend mit Stickstoff getrocknet. Anschließend werden sie mit 0,67 Milligramm pro Milliliter Sci-Fi inkubiert.Markierte BSA-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur während der Inkubation; epoxymodifizierte Glasdeckchen werden auf dieselbe Weise gereinigt. Auf dieselbe Weise werden die Stempel nach dem Einfärben mit PBS und Wasser gewaschen. Für BSA sci fünf Transfer.Ein Stempel wird mit Stickstoff getrocknet und anschließend sofort unter Eigengewicht unter eine Glasdeckenscheibe für 30 Minuten gelegt. Die Position des Mikromusterfeldes wird auf der Rückseite der Deckenscheibe markiert. Nach dem Entfernen der Stempel werden die Deckenscheiben mit klebenden Silikonmasken versiegelt.Die Kammern werden mit einer Streptavidin-Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter beladen, eine Stunde inkubiert und anschließend mit einem Milliliter PBS gespült. Danach werden die Streptavidin-Muster eine Stunde lang mit einer biotinylierten Antikörperlösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter inkubiert; nach dem Waschen mit PBS werden die Zellen in die Kammer gegeben. Sobald die Zellen an der Oberfläche angeheftet sind, ist die Probe bereit für die Messungen.Die einzige Voraussetzung für die Auslesung ist ein Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, die Probe in Totalreflexionskonfiguration zu beleuchten. Solche Systeme sind kommerziell von verschiedenen Anbietern erhältlich und haben sich in den letzten Jahren für den Benutzer stark vereinfacht. Unser Detektionssystem ist an einem Epi-Fluoreszenzmikroskop aufgebaut.Argon- und Krypton-Ionenlaser werden zur selektiven Fluoreszenzanregung der verwendeten Fluorophore genutzt. Die Proben werden in einer objektivbasierten Totalreflexionsanordnung mit einem hochaperturigen Ölimmersionsobjektiv mit 100-facher Vergrößerung beleuchtet. Nach geeigneter Filterung mithilfe standardmäßiger Filter-Sets wird die Fluoreszenz auf eine rückseitig belichtete CCD-Kamera abgebildet. Die Auslesung erfolgt im Zeitverzögerungs- und Integrationsmodus, wodurch das Scannen großer Probeflächen ermöglicht wird. Hierzu werden die Proben mithilfe eines motorisierten XY-Stages verschoben, der synchron mit der Zeilenverschiebung der Kamera arbeitet.Der rückreflektierte Laserstrahl wird auf einer zweiteiligen Photodiode abgebildet, und das Differenzsignal wird zur Steuerung eines Z-Piezos für eine schnelle Nachfokussierung verwendet. Der Leser ist mit einem automatischen Fokus-Halte-System ausgestattet, das während des Scanvorgangs arbeitet, wobei ein Scan bei 488 Nanometer zur selektiven Anregung von GFP und ein zweiter Scan bei 647 Nanometer zur selektiven Anregung von PS Five erfolgt. Zur Datenanalyse verwenden wir ein in MATLAB geschriebenes Programm zur Kontrastberechnung, das auf der Fluoreszenzintensität innerhalb und außerhalb des erfassten Antikörperbereichs basiert.Die Kontraststufe und damit der Grad der Proteininteraktion wird zur schnellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen untersucht. Auch kommerziell erhältliche automatisierte Software kann verwendet werden. Beispielsweise wurde die von Olympus angebotene scanR-Bildanalyse-Software erfolgreich für die Kontrastauswertung von Mikromusterversuchen getestet.Wir analysieren die bekannte Interaktion von CD4 und LCK mit Proteinen in der frühen T-Zell-Signaltransduktion, wie hier gezeigt. Fluoreszierendes LCK verteilt sich eindeutig neu auf Bereichen, die mit CD4-Antikörpern beschichtet sind. Die Störung der Zink-Clasp-Struktur, die eine Hauptinteraktionsstelle dieser beiden Proteine darstellt, durch Zugabe eines Zink-Chelators verringert den Kontrast der LCK-Mikromuster.Zusammenfassend sind die Hauptvorteile der Mikromustertechnik wie folgt: Quantifizierung lokaler, räumlich aufgelöster Proteinwechselwirkungen. Außerdem die Detektion schwacher Wechselwirkungen auch in der Plasmamembran lebender Zellen, die Nachweisung modulierter Bait-Prey-Wechselwirkungen, Analyse des Ruhezustands und die Anwendbarkeit des Ansatzes für Hochdurchsatzverfahren.

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Forschung

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Biology

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