Name: MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie MISSION esiRNA für Hochdurchsatz-Screens in Säugerzellen nutzen, um Zellzyklusgene zu identifizieren. Diese Methode zeigt optimierte Transfektion und statistische Validierung für zuverlässige RNAi-Ergebnisse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchten die Mitglieder des Buchholz-Labor und die Sigma-Aldrich RNAi-Team zur Diskussion zu bestätigen. Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] für die Unterstützung bedanken. MISSION ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

1. Hochwertige MISSION esiRNA Bibliotheken <ol><li> Für jedes Gen von Interesse am anfälligsten und spezifische Zielregion für RNAi gewählt Nutzung der DEQOR Algorithmus (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 DEQOR Partituren zum Schweigen Potenzial aller möglich 21 Nukleotide lange siRNAs in einem Ziel-mRNA auf State-of-the art Design-Constraints 4. Darüber hinaus wird jeder potenzielle siRNA für mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Genen, indem Sie eine BLAST-Suche gegen das Transkriptom des Organismus untersucht analysiert. Das Programm bietet damit eine Analyse der allgemeinen Qualität und cross-Silencing Kapazitäten der potenziellen esiRNA (300-600 bp Länge). </li><li> Die gewählten Region der Ziel-Gen cDNA durch PCR mit genspezifischen Primern von Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor-Sequenzen flankiert verstärkt. </li><li> Jeder PCR-Produkt für MISSION esiRNA Produktion verwendet wird, für die Identität durch Sequenzierung und für die Reinheit von Caliper LabChip verifiziert. </li><li> Lange doppelsträngige RNA wird aus dem PCR-Produkt durch die RNA-Polymerase, durch ein Glühen der transkribierten Stränge verfolgt transkribiert. </li><li> esiRNAs sind begrenzt durch enzymatische Verdauung der langen doppelsträngigen RNA mit RNaseIII durch Reinigung über Anionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose Spin-Säulen, hergestellt. </li><li> esiRNAs werden gefällt und resuspendiert in TE-Puffer. Die Ausbeute wird durch UV-Absorptionsmessungen gemessen und die Konzentration wird durch Lösen in einem geeigneten Volumen TE-Puffer eingestellt. Die Qualität des Endprodukts wird durch Caliper LabChip Analyse überprüft. </li></ol> 2. Die Wahl einer Zelllinie und die Optimierung der Transfektion für das Screening <ol><li> Titrieren Mengen esiRNA (Verwendung Eg5 als positiv und Renilla-Luciferase als Negativ-Kontrolle) und steigende Mengen an Transfektionsreagenz in einer 384-Well-Platte, fügen Zellen und inkubieren für 48 Stunden. Eg5 ist ein Kinesin-Motorproteine ​​für bipolare Spindel-Anordnung und eine Depletion führt zu einer mitotischen verhaften. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Transfektionsreagenzien und Zelllinien. Hier verwenden wir HeLa-Zellen kultiviert folgenden Standardverfahren und oligofectamine (Invitrogen) als Transfektionsreagenz. </li><li> Für die Auswahl der optimalen Transfektionsbedingungen zählen die Zellen mit Eg5 esiRNAs, dass eine Mitose (runde Form) und die Gesamtzahl der Zellen mit Renilla-Luciferase (RLuc) esiRNA mittels Lichtmikroskopie transfizierten zeigen transfiziert. Wählen Sie den Zustand mit der geringsten Toxizität für RLuc und am ausgeprägtesten Phänotyp für Eg5. Eine alternative Methode für die Optimierung der Transfektion Bedingungen beinhaltet eine stabile Zelllinie EGFP (oder ein anderes geeignetes Reportergen) unter der Kontrolle eines konstitutiven aktiven Promotor. Nach der Transfektion eines esiRNA gegen EGFP (oder einem anderen Reporter-Gen) und RLuc (oder einem anderen geeigneten Negativkontrolle esiRNA) messen knock-down Wirksamkeit und Toxizität von zB Fluoreszenz unterstützt Zellsortierung (FACS). Stellen Sie sicher, dass die verwendeten esiRNA für EGFP vollständig komplementär zu den Ziel-mRNA ist. </li></ol> 3. Einrichten des primären Bildschirms 5,6 <ol><li> Optimieren Sie die Pipettiergenauigkeit für alle verwendeten Komponenten auf einem automatischen Pipettieren Station (zB Aquarius, Tecan und WellMate, Matrix). Da Pipettieren Parameter auf die Art von Lösung, Volumen und Plattentyp ändern sich in Abhängigkeit dieser Optimierung muss für jeden Schritt einzeln wiederholt werden. Wenn möglich, sollte das Pipettieren Station unter einer Sterilbank platziert werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Alle verwendeten Komponenten sollten vor der Verwendung desinfiziert werden entweder durch Autoklavieren ggf. oder durch Besprühen mit 75% Ethanol. Optimieren wash-Protokolle, so dass eine Kreuzkontamination von Brunnen zu Brunnen ist ausgeschlossen. Details für die Optimierung von Pipettierautomaten kann nicht geben, für die Raum-Einschränkungen und hängen stark von der verwendeten Pipettierstation. Für weitere Informationen beziehen sich auf die Hersteller-Protokoll. </li><li> Transfektion von Zellen in 384-Well-Format mit den optimierten Bedingungen von oben mit esiRNAs für Eg5 und RLuc. Verwenden Sie ein abwechselndes Muster für Eg5 und RLuc esiRNA über die gesamte Platte. </li><li> Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden beheben die Zellen mit kaltem 100% Ethanol in PBS rehydriert für 15 Minuten, Edelstahl für 25 Minuten in PBS mit 1 pg / ml DAPI und 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Schließlich mit PBS und speichern Waschen bei 4 ° C. </li><li> Messen Sie die Intensität der DAPI-Fluoreszenz-Mikroskopie durch z. B. auf einer Olympus ScanR System. Generieren Sie ein Histogramm durch Auftragen DAPI-Intensität gegen die Zellzahl und Auswertung der Zellzyklus-Verteilung durch die Berechnung der Anteil der Zellen mit der DNA-Gehalt 2N für G1-Phase; &lt;2N&gt; 4N für S-Phase; 4N für G2/M-phase und &gt; 4N für Aneuploidie / Polyploidie. </li><li> Beurteilen Sie die Homogenität der Ergebnisse über die Platte. Eine weitere Optimierung ist notwendig, wenn die Ergebnisse signifikant zu positionieren effe auszuschließencts. Ein häufiges Problem bei der Verwendung von Multi-Well-Platten wird verbessert Verdunstung am Rande Brunnen während Inkubationszeit. Dies führt zu unterschiedlichen experimentellen Bedingungen in verschiedenen Vertiefungen, die oft übersetzt Platte-Position spezifische Wirkungen. Aus diesem Grund empfehlen wir allen Rand Brunnen leer für einen Bildschirm zu verlassen. Zur weiteren Minimierung Verdunstung sorgen dafür, dass die Inkubatoren bei hoher Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden. Wir setzen routinemäßig Verdunstung Barrieren wie Corning Atmungsaktive Dichtungsband, die Verdunstung zu blockieren. Auch andere Ressourcen für die Position Effekte zu berücksichtigen, z. B. technische Veränderung der Anzeige-System (Mikroskop, Platten-Lesegerät, etc) oder Variationen in Liquid Handling (Steigungen, Inhomogenität der Lösungen, etc.) entnommen werden. </li><li> Die statistischen Unterschiede zwischen positiven und negativen Kontrollen stellen ein Maß für die Bedeutung des Tests verwendet. Ein großer Unterschied zwischen negativen Kontrolle (oder Hintergrundgeräusche; Mock-Kontrolle) und Probe muss vor Beginn der eigentlichen Screening festgestellt werden. Ein gutes Maß für die statistische Signifikanz der Z-Faktor. Der Z-Faktor ist nach der Gleichung berechnet: Z = 1 - (3 SD [sample] + 3 SD [Mock]) * (| Av [sample] - Av [Mock] |) -1; mit SD: Standardabweichung, Av: Durchschnitt. Ein Z-Faktor von 1&gt; Z&gt; 0,5 zeigt eine statistisch signifikante Trennung der negativen Kontrollen (und Lärm) von den positiven steuert 7. </li></ol> 4. Primäre Bildschirm <ol><li> Bereiten Sie 384-well-Zellkulturplatten für die Transfektion von esiRNAs Nutzung der optimierten Bedingungen von oben. Hier verwenden wir 15NG esiRNA pro Well in 5μl TE-Puffer gelöst. Mindestens acht Kontrolle Positionen pro Platte sollte mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen für den biologischen Prozess untersucht (: Eg5 und RLuc hier) geladen werden. Um zu vermeiden, Position Effekte Rande Vertiefungen werden mit 5μl TE-Puffer nur geladen. </li><li> Add 5μl OptiMEM (Invitrogen) mit 0.2μl Oligofectamine pro Well, Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Add Zellsuspension auf die Transfektion Mischung (hier: 40 ul einer HeLa Zellsuspension bei 25 Zellen / ul Konzentration; äquivalent zu 1000 Zellen pro well) und Inkubation für 72 Stunden. </li><li> Messen DNA-Inhalte auf einem automatisierten Mikroskop (Olympus ScanR, siehe oben). Bewerten mit Z-score-Statistik für hit Auswahl: Z-Scores werden für alle Proben esiRNAs mit dem Signal für die negative Kontrolle als Referenz berechnet. Beachten Sie, dass die Z-score nicht das gleiche wie das Z-Faktor. Z-Scores bieten ein statistisches Maß für die Bedeutung der Abtastwerte im Vergleich zu einem (Mock-) Kontrolle. Es ist nach der Gleichung berechnet: Z = (Wert [Sample] - durchschnittlich [Mock]) * Standard-Abweichung [Mock] -1. Für Hit Auswahl eines Schwellenwerts muss angewendet werden. In der Regel wie eine Bedeutung Kriterien: 2 &lt;Z &lt;-2 verwendet wird, sondern abhängig von der Qualität des Datensatzes, der studierte biologischen Prozess oder einfach nur den Rahmen des Bildschirms, unterschiedliche Schwellenwerte könnten erhoben werden. Neben den recht einfach Z-score Statistiken auch aufwändigere mathematische Auswerteverfahren verwendet werden (ein erster Einblick in das weite Feld der statistischen Auswertung der Screening-Daten können in Malo et al. 8). </li></ol> 5. Sekundäre Bildschirm und drücken Sie die Validierung <ol><li> Ein zweiter Bildschirm folgt den primären Bildschirm, um Fehlalarme aufgrund von experimentellen Fehlern oder Off-Target-Effekte zu beseitigen. Für die ausgewählten hits dem gleichen Verfahren wie in den primären Bildschirm verwendet werden, sollten für eine größere Anzahl von Wiederholungen (3-5) wiederholt werden, um eine bessere statistische Auswertung zu ermöglichen. </li><li> Für überprüft trifft ein sekundärer, nicht-überlappenden esiRNA (oder ein anderes nicht-überlappenden silencing Trigger) gegen die Ziele in den ersten Screens identifiziert verwendet werden sollte. Das gleiche Test und Auslesen sind als für den primären Bildschirm verwendet werden. </li><li> Letztendlich ist die ausgewählten Gene können durch cross-species RNAi Rettung 9 validiert werden. Dadurch wird eine bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Verschlüsselung, wie zB die Maus Ortholog des Gen stabil in Zellen transfiziert. BAC-Konstrukte erhalten ein Gen in ihrer genomischen Kontext und ermöglichen eine fast-physiologische Ausdruck. RNAi gegen die endogenen menschlichen Gen verlassen die Maus Transgenexpression unverändert, die die RNAi-Phänotyp-rettet. RNAi-Rettung bietet der Gold-Standard für die Überprüfung der RNAi-Phänotypen bislang nicht verfügbar. </li><li> Schließlich werden die validierten Kandidaten im Detail untersucht, um schließlich daraus mechanistische Verständnis. In vielen Fällen RNAi kann in diesen Experimenten verwendet werden, zB in der Sekundarstufe, aufwändigere Tests. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Autoren erklären, finanzielle Beziehungen mit kommerziellen Unternehmen, die ein Interesse an der eingereichten Arbeit haben könnte.

RNA-Interferenz hat sich zu einem Standard-Technik, um loss-of-function Phänotypen studieren. Groß angelegte Sammlungen von RNAi-Mediatoren sind von verschiedenen Herstellern erhältlich und bieten eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode für die Gen-Silencing. Diese öffnete sich das Tor für das systematische Screening für Key-Player in vielen biologischen Prozessen ermöglicht ein Genom-Skala Perspektive auf eine Vielzahl von verschiedenen Arten und Zelltypen. Hohe falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse sind eine gemeinsame Herausforderung in RNAi-Screens. Um dieses Problem anzugehen, haben erhebliche Anstrengungen investiert, um die Wirksamkeit zu verbessern und insbesondere die Spezifität der silencing auslöst. Eine wichtige Entdeckung war, dass ein Pool von verschiedenen siRNAs demselben Transkript stark erhöht Zielspezifität. Da ein sehr komplexes Pool von verschiedenen siRNAs durch die Endoribonuklease produziert wird, werden esiRNAs hohen Zielspezifität auslöst, die Verringerung der Quote an falsch positiven RNAi-Screens. esiRNAs haben auch gezeigt, um eine effiziente Niederschlägen zu erreichen, wodurch auch die falsch-negative Rate. Da RNAi-Screens technisch anspruchsvoll sind, werden sie wahrscheinlich schwierig bleiben, um auf einem Routine-Basis für einige Zeit durchzuführen. Doch wie bekommen Reagenzien und Instrumente besser und Labors teilen ihre Erfahrungen, sind die Verwendung von RNAi-Screens in der modernen Biologie als auch in Zukunft zu erhöhen.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Für weitere Informationen kontaktieren Sie: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atmungsaktives Verschlussband</td><td>Corning</td><td>Atmungsaktives Verschlussband, steril (Produkt #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (absolut), für Molekularbiologie</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphatgepufferte Salzlösung&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, 10x-Konzentrat, geeignet für Zellkultur, für Molekularbiologie</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Pulver, BioReagent, geeignet für Zellkultur, &amp;gt;98 % (HPLC und TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuklease A aus Rinderpankreas&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Für Molekularbiologie, &amp;#8805;70 Kunitz-Einheiten/mg Protein, lyophilisiertes Pulver</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA-Pufferlösung&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, für Molekularbiologie</td></tr></tbody></table>

mission esirna für rnai-screening in säugerzellen

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA-Interferenz (RNAi) ist eine grundlegende zelluläre Mechanismus für die Kontrolle der Genexpression. RNAi wird von kurzen doppelsträngigen RNAs auch als small interfering RNAs (siRNAs) bezeichnet induziert. Die kurze doppelsträngige RNAs stammen aus mehr doppelsträngigen Vorstufen durch die Aktivität von Dicer, ein Protein der RNase III Familie von Endonukleasen. Die resultierenden Fragmente sind Bestandteile des RNA-induced silencing complex (RISC), lenkt sie auf die verwandten Ziel-mRNA. RISC spaltet die Ziel-mRNA wodurch die Expression des kodierten Proteins 1,2,3. RNAi hat sich zu einem mächtigen und weit verbreiteten experimentellen Methode für den Verlust der Genfunktion Studien in Säugerzellen Nutzung small interfering RNAs. Derzeit sind zwei wichtigsten Methoden sind für die Produktion von small interfering RNAs. Eine Methode besteht in der chemischen Synthese, während eine alternative Methode beschäftigt endonukleolytische Spaltung der Ziel-spezifischen langen doppelsträngigen RNAs von RNase III in vitro. Dabei ist eine vielfältige Pool von siRNA-Oligonukleotide wie erzeugt, die auch als Endoribonuklease vorbereitet siRNA oder esiRNA bekannt. Ein Vergleich der Wirksamkeit von chemisch abgeleiteten siRNAs und esiRNAs zeigt, dass beide Trigger potent in Ziel-Gen-Silencing sind. Unterschiede können jedoch beim Vergleich Spezifität werden. Viele einzelne chemisch synthetisierte siRNAs herstellen prominenten Off-Target-Effekte, während die komplexen Gemisch innewohnt esiRNAs führt zu einer spezifischen Knockdown 10. In dieser Studie präsentieren wir die Gestaltung der genomweite MISSION esiRNA Bibliotheken und deren Nutzung für die RNAi-Screening durch einen DNA-Gehalt Bildschirm für die Identifizierung von Genen in den Ablauf des Zellzyklus beteiligt veranschaulicht. Wir zeigen, wie die Transfektionsprotokolls und der Test für das Screening in hohem Durchsatz zu optimieren. Wir zeigen auch, wie groß Datensätze können statistisch ausgewertet werden und gegenwärtige Methoden zur primären Treffern zu validieren. Schließlich geben wir mögliche Ansatzpunkte für weitere funktionelle Charakterisierung von validierten Hits.

Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein grundlegender zellulärer Mechanismus zur Steuerung der Genexpression. RNAi wird durch kurze doppelsträngige RNAs induziert, die auch als ... bekannt sind.

Die Untersuchung auf zellzyklusassoziierte Gene mittels RNAi beginnt mit der Auswahl einer geeigneten Knockdown-Technologie, der sogenannten Mission.Easy. Die RNA-Bibliotheken von Sigma Aldrich nutzen die hohe Effizienz und Spezifität von endoribonukleasepräparierten siRNAs. A-easy-RNAs sind komplexe Pools einzelner siRNAs, die durch enzymatischen Verdau langer doppelsträngiger RNA hergestellt werden, die komplementär zur Ziel-mRNA ist. Das Poolen von siRNAs, die dasselbe Transkript targeten, erhöht die Spezifität und vermeidet die aufwändige Suche nach effizienten und spezifischen einzelnen siRNAs.Dies macht die einfache RNA-Biologie besonders geeignet für groß- und mittelmaßstäbliche Funktionsverlust-Screens. Hier zeigen wir die notwendigen Schritte zur Durchführung eines großangelegten RNA-Augen-Screens, beginnend mit der Einrichtung einer Hochdurchsatz-Transfektion bis hin zur Entwicklung eines geeigneten Assays. Dies wird beispielhaft an der Einrichtung eines Screens für Gene demonstriert, die an der Fortschreitung des Zellzyklus in Säugetierzellen beteiligt sind.Zunächst zeigen wir, wie die Transfektion von Hilarzellen optimiert wird, gefolgt von der statistischen Auswertung der Assay-Qualität. Abschließend wird ein genomweiter Screen durchgeführt, bei dem die Zellzyklusverteilung nach Abschaltung des Zielgens gemessen wird. Die Hits werden mithilfe der zco-Statistik ausgewählt und durch sekundäre, unabhängige easy-RNAs verifiziert.Außerdem erläutern wir mögliche experimentelle Verfahren, die zur Nachverfolgung des RNA-Augen-Screens verwendet werden können. Hallo, ich bin Ty vom Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik. Und Tristan.Ich bin Frank Al, ebenfalls vom Marx-Plunk-Institut in Dresden. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung eines Funktionsverlust-Screens in Säugetierzellen unter Verwendung von Mission-easy-RNAs von Sigma Aldridge. Ein Assay zur Messung der Zellzyklusverteilung in einer Population von Zellkulturzellen dient als Beispiel, um zu demonstrieren, wie Gene mithilfe eines RNAi-Screens mit biologischen Prozessen verknüpft werden können.Beginnen wir also. Jedes RNAi-Screening-Projekt beginnt mit der Wahl der Stummschaltungs-Trigger, sogenannte endogene Ribonuklease-hergestellte siRNAs, kurz easy RNAs, die durch begrenzte enzymatische Verdauung langer doppelsträngiger RNA mittels RNase III erzeugt werden. Jede easy RNA wird mittels Sequenzierung auf Identität und mittels Caliper Lab-Chip-Analyse auf Reinheit überprüft.Die Zusammenfassung einzelner siRNAs, die alle dasselbe Transkript ansprechen, erhöht die Spezifität, da jede irna im Pool denselben On-Target besitzt, während die Off-Target-Effekte verdünnt werden. Daher weisen easy RNAs eine gute Stummschaltwirkung und hohe Targetspezifität auf und vermeiden Off-Target-Effekte. Genomweite easy.RNA-Bibliotheken werden von Sigma Aldrich bereitgestellt. In 384-Well-Platten sind die Randwells leer. Zusätzlich werden acht Positionen in der Mitte der Platte für Kontrollen frei gelassen.Teilbibliotheken von einfachen RNAs werden in 96-Well-Platten geliefert, bei denen alle Vertiefungen belegt sind; die Kunden können selbst festlegen, wie die einfachen RNAs auf diesen Platten angeordnet werden. Individuelle einfache RNAs werden in einzelnen Röhrchen bereitgestellt. Die Transfektion einfacher RNAs erfordert eine Optimierung je nach verwendeten Transfektionsreagenzien und Zelllinien.Hier heilen unsere Zellen, die nach Standardverfahren kultiviert wurden, unter Verwendung von Oligo als Transfektionsreagenz. Verwenden Sie EEG fünf E-Z-R-N-A-A, ein Kinesin-Motorprotein, das für die Ausbildung bipolarer Spindeln erforderlich ist, als positiven Kontrollfaktor und ran-Luciferase-easy-RNA als negative Kontrolle. In einer 384-Well-Platte titrieren Sie verschiedene Mengen an easy-RNA, beispielsweise von einem Nanogramm bis 56 Nanogramm mit einem Zuwachs von fünf Nanogramm, sowie steigende Mengen an Transfektionsreagenz von 0,1 Mikroliter bis 0,9 Mikroliter mit einem Zuwachs von 0,05 Mikroliter.Nachdem die RNA mit dem Transfektionsreagenz gemischt wurde, die Zellen hinzufügen und 48 Stunden inkubieren. Nach Beendigung der Inkubationszeit die Zellen unter einem Lichtmikroskop überprüfen. Die mit eeg transfizierten Zellen zählen.Fünf einfache RNAs, die eine runde Form zeigen, die auf Mitose hinweist. Zählen Sie außerdem die Gesamtzahl der Zellen, die mit einem negativen Kontrollpräparat transfiziert wurden. Gran-Vanille-Luciferase-einfache RNA.Die optimale Transfektionsbedingung weist die geringste Toxizität für Vanille-Luciferase und den stärksten Phänotyp für EEG fünf auf. Nachdem die Transfektionsparameter optimiert wurden, fahren Sie mit dem Aufbau und dem Primärscreen fort. Automatisierte Pipettierstationen wie Matrix Wellm Mate oder Tecan Aquarius, die zur Herstellung der Primärscreens verwendet werden, sollten unter einer laminarer Luftströmungsschutzhaube platziert werden, um Kontaminationen zu vermeiden.Alle verwendeten Komponenten sollten vor der Anwendung desinfiziert werden, entweder durch Autoklavieren, falls zutreffend, oder durch Besprühen mit 75 %igem Ethanol vor dem Screening. Diese Geräte sollten gemäß den Herstellervorgaben optimiert werden. Optimieren Sie die Pipettiergenauigkeit für alle verwendeten Komponenten an der automatisierten Pipettierstation, da sich die Pipettierparameter je nach Art der Lösung, Volumen und Plattenart ändern können.Diese Optimierung muss für jeden Schritt einzeln wiederholt werden. Außerdem sollten die Waschprotokolle so optimiert werden, dass eine Kreuzkontamination von Brunnen zu Brunnen ausgeschlossen ist, sobald die automatisierten Pipettierstationen bereit sind. Transfizieren Sie die Zellen im 384-Brunnen-Format unter Verwendung der zuvor bestimmten optimierten Bedingungen, um sicherzustellen, dass keine Positionseffekte auftreten.Verwenden Sie leicht verfügbare RNAs für EEG fünf und Vanille-Luciferase in einem sich abwechselnden Muster, das die gesamte Platte bedeckt. Lassen Sie alle Rand-Wellen leer, da ein häufiges Problem bei der Verwendung von Mehrfach-Well-Platten eine verstärkte Verdunstung in den Rand-Wellen während der Inkubationszeit ist. Dies führt zu unterschiedlichen experimentellen Bedingungen in verschiedenen Wells, was oft zu platzspezifischen Effekten führt. Um die Verdunstung weiter zu minimieren, verwenden Sie Verdunstungssperren wie Corning Breathable Sealing Tape.Stellen Sie außerdem sicher, dass die Inkubatoren eine hohe Luftfeuchtigkeit aufweisen. Beachten Sie jedoch, dass mögliche Quellen für Positionseffekte, wie Variationen in der Flüssigkeitsmanipulation oder beim Auslesesystem, beispielsweise einem Plattenreader, bestehen können. Nach einer 48-stündigen Inkubation fixieren Sie die Zellen zwei Stunden lang mit eiskaltem, 100%igem Ethanol und rehydrieren sie anschließend 15 Minuten lang in PBS.Färben Sie die fixierten Zellen 25 Minuten lang in PBS, das ein Mikrogramm pro Milliliter DPI und 100 Mikrogramm pro Milliliter RNA enthält. Waschen Sie anschließend dreimal mit PBS und lagern Sie bei vier Grad Celsius. Messen Sie danach die Intensität der DPI-Fluoreszenz mittels Mikroskopie.Ein Olympus-Scannersystem wird hierfür jeweils verwendet. Untersuchen Sie die Zellen und bestimmen Sie die relative DPI-Intensität. Erstellen Sie ein Histogramm, indem Sie die DPI-Intensität gegen die Zellanzahl auftragen, basierend auf dem Histogramm.Beurteilen Sie die Verteilung im Zellzyklus, indem Sie den Prozentsatz der Zellen mit einem DNA-Gehalt von 2N für die G1/G0-Phase, zwischen 2N und 4N für die S-Phase und 4N für die G2/M-Phase sowie größer als 4N für Aneuploidie oder Polyploidie berechnen. Um die Homogenität der Ergebnisse über die Platte zu bewerten, vergleichen Sie die Verteilung im Zellzyklus zwischen den verschiedenen Vertiefungen, indem Sie den Prozentsatz der Zellen in der G2/M-Phase für EEG5 und Luciferase-transfizierte Zellen gegenüberstellen. Unterscheiden sich die Ergebnisse signifikant über die Platte, ist eine weitere Optimierung erforderlich, um Positionseffekte auszuschließen. Sobald die Konsistenz der Ergebnisse zufriedenstellend ist, berechnen Sie die statistischen Unterschiede zwischen den positiven und negativen Kontrollen.Verwenden Sie die hier gezeigte Z-Faktor-Gleichung, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. SD steht für Standardabweichung und AV für Mittelwert. Ein Z-Faktor zwischen eins und 0,5 weist auf eine statistisch signifikante Trennung der negativen Kontrollen und der Hintergrundstörungen von den positiven Kontrollen hin.Wenn ein solcher statistischer Unterschied festgestellt wurde, kann mit dem primären Screening fortgefahren werden. Bereiten Sie 384er-Platten für Zellkultur zur Transfektion von easy-RNAs unter Verwendung der hier vorab optimierten Bedingungen vor.15 Nanogramm leichter RNA pro Bohrung werden in fünf Mikrolitern TE-Puffer gelöst. Mindestens acht Kontrollpositionen pro Platte werden mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen für den biologischen Prozess beladen. Untersucht werden hier EEG fünf und ranil-Luciferase.Easy-RNAs werden verwendet, um Positionseffekte zu vermeiden. Die Randmulden werden nur mit fünf Mikrolitern TE-Puffer beladen. Anschließend werden fünf Mikroliter Opti-MEM, die 0,2 Mikroliter Oligo pro Mulden-Mix enthalten, zugegeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Nachdem die RNA mit dem Transfektionsreagenz gemischt wurde, hier die Zellsuspension hinzufügen. 40 Mikroliter einer he-R-Zellsuspension werden mit einer Konzentration von 25 Zellen pro Mikroliter, entsprechend 1000 Zellen pro Vertiefung, hinzugefügt und 72 Stunden inkubiert. Nach der 72-stündigen Inkubation.Messen Sie den DNA-Gehalt an einem automatisierten Mikroskop wie dem Olympus scanR, wie zuvor gezeigt. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle Platten der Bibliothek zur Trefferauswahl. Bewerten Sie die Werte des DNA-Gehalts mithilfe von Z-Score-Statistiken.Beachten Sie, dass der Z-Score nicht dasselbe ist wie der Z-Faktor-Z-Score. Er liefert ein statistisches Maß für die Signifikanz eines Probenwerts im Vergleich zu einer negativen Kontrolle oder einer Mock-Kontrolle. Er wird gemäß der hier gezeigten Gleichung berechnet.Berechnen Sie den zco-Wert für alle easy-RNA-Proben unter Verwendung des Signals der negativen Vanilla-Luciferase-Kontrolle als Referenz für die Trefferselektion. Es muss ein Schwellenwert angewendet werden. Üblicherweise wird ein Signifikanzkriterium für Z verwendet, das größer als zwei oder kleiner als minus zwei ist. Abhängig vom untersuchten biologischen Prozess oder vom Umfang des Screenings können jedoch unterschiedliche Schwellenwerte angewendet werden.Aufwendigere mathematische Auswertemethoden wie die Q können ebenfalls zur Trefferauswahl verwendet werden. Anschließend werden die ausgewählten Treffer einer sekundären Bildschirmung und einer HIIT-Validierung unterzogen. Eine sekundäre Bildschirmung der ausgewählten HIIT-Gene folgt auf den Primärscreen, um Falschpositive aufgrund experimenteller Variationen auszuschließen.Überprüfen Sie zunächst die ausgewählten Hits mit demselben Verfahren wie beim Primärscreen, richten Sie die Hits jedoch mit einer höheren Anzahl von Wiederholungen – zwischen drei und fünf – ein, um eine bessere statistische Auswertung zu ermöglichen. Verwenden Sie für die verifizierten Hits denselben Assay und denselben Nachweis wie beim Primärscreen, jedoch mit einem sekundären, nicht überlappenden easy-RNA-Molekül oder einem anderen nicht überlappenden Stummschaltungs-Trigger, beispielsweise einem chemisch synthetisierten si-RNA-Molekül. Validieren Sie die ausgewählten Gene abschließend durch einen Vergleich über Arten hinweg.Die RNAi-Rettung ist der Goldstandard zur Überprüfung von bislang verfügbaren RNAi-Phänotypen. Kurz gesagt, wird ein bakterieller künstlicher Chromosom (abgekürzt BAC), das ein orthologes Gen eines anderen Spezies des ausgewählten Gens kodiert, stabil in Zellen transfiziert. BAC-Konstrukte bewahren das Gen in seinem genomischen Kontext und ermöglichen eine nahezu physiologische Expression.Die RNAi gegen das endogene Gen lässt die Expression des ortho-Transgens unverändert, wodurch das RNAi-Phänotyp gerettet wird. Schließlich werden die validierten Kandidaten detaillierter untersucht, um letztlich ein mechanistisches Verständnis zu erlangen. In vielen Fällen kann die RNAi auch in diesen sekundären, aufwändigeren Assays verwendet werden.Zum Beispiel die Zeitraffer-Mikroskopie von RNAi-Phänotypen. Hier sehen Sie ein Beispiel für einen Zellzyklus-Screen, bei dem der DNA-Gehalt von HeLa-Zellen nach Herunterregulation von mehr als 16.000 Genen aus dem menschlichen Genom gemessen wurde. Es wurden 1.351 primäre Treffer identifiziert, die für die Zellteilung erforderlich sind.Im sekundären Screening wurden 743 Hits mit einem sekundären, unabhängigen, einfachen RNA-Trigger unter Verwendung eines sekundären Assays verifiziert. Knockdowns, die zu einer G2-Arrest führten, wurden von Knockdowns getrennt, die einen mitotischen Arrest verursachten. Schließlich wurde ein RNA-Auge-Rettungsexperiment über mehrere Arten hinweg für das Gen Lin 54 durchgeführt, um dessen Rolle bei der korrekten Zellteilung zu bestätigen.Weitere nachgeschaltete Experimente zeigten, dass die Depletion von Lin 54 die Expression vieler Zellzyklus-Gene veränderte. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Hochdurchsatz-Transfektion von Mission-easy-RNAs und die Analyse der Zellzyklusverteilung in der humanen Zellkulturzelllinie einrichtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Transfektionsbedingungen und Assays für jedes zelluläre System und jeden biologischen Prozess separat optimiert werden müssen.Die Verwendung automatisierter Flüssigkeitsmanagementsysteme wird empfohlen, ist jedoch besonders bei kleineren Screening-Vorhaben nicht unbedingt erforderlich. Eine manuelle Handhabung ist ebenfalls möglich. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

Hier verwenden wir ein menschliches LentiPlex gebündelt Bibliothek und traditionelle Methoden zur Sequenzierung Gen-Targets zu fördern Überleben der Zelle zu identifizieren. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Dekonvolution ein LentiPlex Bildschirm und Validierung der Ergebnisse.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

SINEUPs sind synthetische antisense nicht-kodierende RNAs, die enthalten eine Bindung (BD) und ein Effektor-Domäne (ED) und Übersetzung bis zu regulieren Ziel mRNA. Hier beschreiben wir Nachweismethoden für SINEUPs in kultivierten Zelllinien, Analyse ihrer Tätigkeit zur Förderung der Übersetzung von Western-Blot und eine halbautomatische Hochdurchsatz imaging-System.

Zellbasierte Assays der SINEUP nicht-kodierende RNAs, die speziell mRNA Übersetzung verbessern können

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Erfahren Sie, wie Sie MISSION esiRNA für Hochdurchsatz-Screens in Säugerzellen nutzen, um Zellzyklusgene zu identifizieren. Diese Methode zeigt optimierte Transfektion und statistische Validierung für zuverlässige RNAi-Ergebnisse.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

Weitere Videos entdecken