0 Aufrufe • 3:12 Min. • April 30th, 2023
- Um mit der Dissektion zu beginnen, greifen Sie mit einer Pinzette den Larvenkörper in der Mitte und mit einem zweiten Paar die Larve in zwei Hälften. Kneifen Sie dann den Mundhaken am vorderen Ende ein, während Sie den Körper an der hinteren Seite halten. Schieben Sie dann die Pinzette, die den Mund hält, in den Körper. Falte mit der hinteren Pinzette die Körperwand auf links.
Bei diesem Präparat können die Speicheldrüsen und der Darm leicht identifiziert und entfernt werden, um das Gehirn und die Imaginalscheiben freizulegen. Zu sehen sind die Fühler-, Augen-, Bein-, Flügel- und Halfterscheiben. Nach dem Fixieren wird das Larvenpräparat auf einen Objektträger mit Eindeckmedium übertragen, wo die Scheiben weiter präpariert werden können. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie man mit diesem Larvenpräparat Flügel-Imaginalscheiben präpariert.
- Verwenden Sie zunächst einen Holzstab oder eine stumpfe Pinzette, um wandernde Larven des dritten Stadiums in eine Petrischale mit PBS zu übertragen. Anschließend werden sie unter Fluoreszenzlicht genotypisiert, um die geeigneten Fluoreszenzmarker für Mosaiklarven zu identifizieren. Bevor Sie fortfahren, waschen Sie die Larven mit PBS. Verwenden Sie dann unter einem Seziermikroskop zwei Pinzettenpaare, um die Mitte der Larve einzuklemmen und den Körper in zwei Hälften zu reißen. Kneifen Sie als Nächstes die Mundhaken zusammen, während Sie den Mund in Richtung Körper drücken, um den Körper auf links zu drehen. Entfernen Sie dann unnötige Materialien wie die Speicheldrüsen und Fettkörper. Die Larven werden nun für die Fixierung und Antikörperfärbung vorbereitet, die im Textprotokoll detailliert beschrieben ist.
Übertragen Sie die gefärbten Gewebepräparate mit einer zwei Milliliter Kunststoff-Transferpipette auf einen Objektträger. Bewegen Sie dann die einzelne Larve mit einer Pinzette in Tropfen Einbettmedium auf einem Objektträger. Isolieren Sie nun mit einer Pinzette die imaginalen Scheiben. Beginnen Sie damit, das Ende des präparierten Gewebes nach unten zu halten und die Antennenscheiben des Gehirns und des Auges mit der anderen Pinzette wegzuziehen. Halten Sie das Gehirn einsatzbereit.
Lokalisieren Sie nun die Flügel-Imaginalscheiben. Die Flügel-Imaginalscheiben werden an die laterale Seite des präparierten Gewebes geklebt. Sichern Sie anschließend das Gewebe mit einer Pinzette und kratzen Sie die Flügelscheiben vorsichtig ab. Positionieren Sie dann die Gehirne in der Nähe der Flügelscheiben, um sie vor dem Zerquetschen durch das Deckglas zu schützen. Decken Sie nun die Strukturen vorsichtig mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Lagern Sie den Objektträger bei 4 Grad Celsius.