Island Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Bewertung des Fortbewegungsverhaltens von Drosophila

- Der Insel-Assay besteht aus einer erhabenen weißen Plattform in einer Schale mit Seifenwasser, die von einer transparenten Schachtel mit einer offenen Seite bedeckt ist. Eine Kamera auf der Oberseite des Kastens zeichnet Overhead-Bilder der Plattform auf, und die Leuchten sind so platziert, dass eine gleichmäßige Ausleuchtung des Bereichs gewährleistet ist.

Um die Fliegen auf die Arena zu laden, klopfe mit einem Fläschchen gegen eine ebene Fläche, um alle Fliegen nach unten zu bringen. Entferne in schneller Folge den Stopfen des Fläschchens, drehe das Fläschchen um und klopfe das offene Ende des Fläschchens auf die Plattform, um alle Fliegen gleichzeitig herauszuschlagen. Die Landung auf der Plattform löst eine Fluchtreaktion aus. Fliegen mit typischer Beweglichkeit können die Plattform in wenigen Sekunden räumen, im Gegensatz zu Fliegen mit Bewegungsdefekten.

Die Motive sind auf die Schachtel beschränkt, und diejenigen, die auf dem Seifenwasser landen, tauchen schnell unter, da die Seife die Oberflächenspannung des Wassers verringert. Um das Fortbewegungsverhalten unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, zählen Sie die verbleibenden Fliegen auf der Plattform nach einem festgelegten Zeitraum.

In diesem Beispielprotokoll sehen wir einen Aufbau des Inselassays, der mit der halbautomatischen Bildanalyse kompatibel ist.

- Bereiten Sie zunächst mindestens drei Fläschchen pro Versuchsbedingung als biologische Replikate vor. Jede Durchstechflasche sollte ca. 15 Fliegen gleichen Geschlechts und ähnlichen Alters enthalten. Wichtig ist, dass die Fliegen intakte Flügel haben.

Erstellen Sie die Ordner zum Speichern der Experimente. Generieren Sie diese in einer Verzeichnisstruktur, die durch die Bedingungen und Replikate definiert ist. Wenn das Experiment z. B. zwei Genotypen mit jeweils fünf Replikationen enthält, erstellen Sie einen Hauptordner mit dem Datum des Experiments, und erstellen Sie in diesem Ordner einen Unterordner für jeden Genotyp. Erstellen Sie dann in den Genotyp-Ordnern Unterordner für jedes Replikat.

Richten Sie anschließend das Prüfgerät ein. Geben Sie kaltes Wasser mit etwas Seife auf das Badetablett und positionieren Sie die Plattform in der Mitte der Badewanne, falls nicht bereits in der Badewanne fixiert. Decken Sie das Tablett und die Plattform mit einer durchsichtigen Box ab.

Um die Plattform zu beleuchten, positionieren Sie eine kühle Lampe, z. B. gewöhnliche 12-Volt-LEDs, darüber. Positionieren Sie außerdem eine Webcam, die an einen Computer angeschlossen ist, direkt über der Plattform.

Öffnen Sie auf dem Computer die Bildaufzeichnungssoftware. Wählen Sie im Menü die entsprechende Webcam als Aufnahmegerät aus. Platziere eine tote Fliege auf der Insel, um die Videoeinstellungen anzupassen. Passen Sie die Helligkeit, den Kontrast und die Farbe in der Software so an, dass die tote Fliege vor einem weißen Hintergrund schwarz erscheint.

Passen Sie als Nächstes die Einrichtung des Zeitrafferfilms an, um die Filme als AVI-Dateien zu speichern. Navigieren Sie dann zu dem Verzeichnis, in dem die Daten gespeichert werden sollen, und definieren Sie den Namen des Films. Speichern Sie diese Änderungen.

Wählen Sie für die Komprimierung der Bilddaten den Intel IYUV-Code aus. Stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf ein Bild alle 0,1 Sekunden ein und stellen Sie die entsprechende Wiedergaberate auf 10 Bilder pro Sekunde ein.

Gehen Sie abschließend zur Einstellung Erweitert und wählen Sie für jeden aufgenommenen Frame die Option BNP-Bild erstellen aus. Navigieren Sie dann zu demselben Verzeichnis, das Sie zum Hosten der AVI-Dateien ausgewählt haben, und drücken Sie OK.

Bevor du beginnst, vergewissere dich, dass die Insel leer und sauber ist. Starten Sie dann die Aufnahme in der Zeitraffer-Bildoberfläche der Bildaufzeichnungssoftware.

Nimm ein Fläschchen mit Fliegen und klopfe zwei- oder dreimal darauf, um alle Fliegen auf den Boden zu schlagen. Entfernen Sie dann schnell den Stopfen aus dem Fläschchen und klopfen Sie die Fliegen kräftig auf die Plattform. Sie sollten alle ungefähr zur gleichen Zeit auf der Plattform erscheinen.

Gib den Fliegen bis zu 30 Sekunden Zeit, um die Plattform zu verlassen. Stoppen Sie dann die Aufnahme. Entfernen Sie bei Bedarf manuell alle verbleibenden Fliegen von der Plattform.

Bevor Sie mit dem nächsten Experiment fortfahren, stellen Sie sicher, dass Sie das Verzeichnis neu definieren, in dem der nächste Datensatz gespeichert werden soll.