Zwei-Photonen-Laser-induzierte neuronale Verletzung: Eine Methode zur Beobachtung der Axondegeneration und -regeneration bei Drosophila-Larven

- Beginnen Sie damit, eine saubere, betäubte Larve mit dem Kopf nach oben unter ein Glasdeckglas zu setzen. Legen Sie als Nächstes den interessierenden Bereich frei, indem Sie vorsichtig auf den Deckschirm drücken, um die Larve zu rollen und ihre Position anzupassen. Verwenden Sie die konfokale Bildgebung, um die Nervenzellen der Larve zu lokalisieren. Identifizieren Sie ein bestimmtes Axon auf einer der Zielnervenzellen als Verletzungsstelle.

Setzen Sie dann das Zielaxon einem Zwei-Photonen-Laser mit einer höheren Leistung aus, als sie für die Bildgebung verwendet wird, um Schäden zu verursachen. Ein Zwei-Photonen-Laser wird aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, Schäden im lebenden Gewebe mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes zu durchdringen und präzise zu lokalisieren.

Stoppen Sie die Laserbelichtung sofort, wenn das Zielneuron beschädigt wird, was zu einer Axotomie oder Durchtrennung des Axons führt. Stellen Sie sich schließlich das verletzte Neuron vor, um seine Degeneration und anschließende Regeneration zu den gewünschten Zeitpunkten zu sehen.

Im Beispielprotokoll werden wir eine Larve für die Mikroskopie montieren, Schäden an sensorischen Neuronen der Larven induzieren und die neuronale Regeneration verfolgen.

- Beginnen Sie mit einer Betäubung der Larven. Stellen Sie in einem Abzug eine 60-Millimeter-Glasschale in eine 15 Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff. Falten Sie dann ein Stück Seidenpapier und legen Sie es in die Glasschale. Legen Sie die Trauben-Agar-Platte auf das Gewebe, nachdem der Diethylether hinzugefügt wurde.

Geben Sie dann auf einen Objektträger einen Tropfen Halogenkohlenwasserstoff-27-Öl in die Mitte und geben Sie einen Fleck Vakuumfett auf jede der vier Ecken. Übertragen Sie dann mit einer Pinzette eine Larve auf die Agarplatte und decken Sie die Glasschale ab, um die Larve zu betäuben. Sobald sich die Lava nicht mehr bewegt, überträgst du sie vorsichtig mit aufrechtem Kopf in das Halogenkohlenwasserstofföl. Legen Sie dann einen Deckzettel über den Objektträger und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, bis er die Larve berührt.

Schieben Sie dann mit sanfter Kraft den Deckglas, um die abzutragenden Zellen an die Stelle zu rollen, an der der Zwei-Photonen-Laser sie am leichtesten trifft. Die Position variiert je nachdem, welche Neuronen angegriffen werden. Befestigen Sie nun die Baugruppe auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch und fokussieren Sie sich mit einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv auf die interessierenden Zellen.

Wechseln Sie in der Software in den Scan-Modus und laden Sie das gespeicherte Protokoll. Achte darauf, dass die Lochblende ganz geöffnet ist. Im Live-Modus erhalten Sie dann ein gutes Bild des interessierenden Bereichs.

Stoppen Sie anschließend den Live-Scan, sodass die Schaltfläche zum Zuschneiden verfügbar wird. Mit der Zuschneidefunktion können Sie das Scanfenster so anpassen, dass der Zielbereich nur auf die potenzielle Verletzungsstelle fokussiert wird. Öffnen Sie dann ein neues Imaging-Fenster. Reduzieren Sie nun die Scangeschwindigkeit und erhöhen Sie die Laserintensität. Schalten Sie dann die Endlostaste um, um den Scan zu starten und zu stoppen. Beobachten Sie genau. Sobald die Fluoreszenz drastisch ansteigt, beenden Sie den Scan.

Wechseln Sie als Nächstes zurück zum ursprünglichen Bildfenster, wählen Sie den Live-Modus aus und suchen Sie den Bereich, der gerade durch Anpassen des Fokus anvisiert wurde.

- Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Verletzung ist das Auftreten eines kleinen Kraters, einer ringförmigen Struktur oder lokalisierter Trümmer direkt an der Verletzungsstelle. Wenn die Laserleistung zu hoch wäre, wäre eine große beschädigte Stelle sichtbar, die tödlich sein kann.

- Entfernen Sie nun vorsichtig den Deckglas und setzen Sie die verletzte Larve auf einen neuen Teller mit Hefepaste. Legen Sie die Platte zusammen mit einem mit Propionsäure getränkten Taschentuch in eine 60-Millimeter-Schale. Stellen Sie dann die Platte wieder auf Kulturtemperatur ein.

Für die anschließende Bildgebung der Larve verwenden Sie das gespeicherte konfokale Setup und sammeln Sie Z-Stapel-Bilder mit einem 25-fach-Objektiv. Achten Sie darauf, den Normalisierungspunkt anzugeben, damit die Regeneration quantifiziert werden kann.