Screening auf genomische Modifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

- Wenn sich injizierte Embryonen zu G0-Erwachsenen entwickeln, kreuzen Sie alle einzelnen Fliegen mit geeigneten Balancer-Stämmen, um potenzielle F1-CRISPR-editierte Linien zu erweitern und die Vererbung der genomischen Modifikation verfolgen zu können. Kreuzen Sie dann zufällig ausgewählte F1-Einzelmännchen mit geeigneten Balancer-Hündinnen, um Nachkommen wiederfinden zu können, wenn ein F1-Männchen positiv für die Mutation ist. Sobald die Kreuzung genommen wurde, übertragen Sie den F1-Stecker zum Screening in ein Röhrchen.

Um genomische DNA zu extrahieren, zerdrücken Sie die Fliege mit einer Pipettenspitze, die Extraktionspuffer enthält. Sobald das Gewebe abgebaut ist, stoßen Sie die Flüssigkeit aus. Der Extraktionspuffer enthält Proteinase K, ein Enzym, das Proteine in der Probe verdaut und durch hohe Hitze inaktiviert wird.

Jetzt, da die DNA zugänglich ist, fahren Sie mit dem PCR-Screening fort. Verwenden Sie z. B. Primer, die so konzipiert sind, dass sie einen Bereich amplifizieren, der die neue Sequenz enthält. Erst in Gegenwart der Modifikation bindet der zweite Primer und ein PCR-Produkt wird amplifiziert. In diesem Beispiel sehen wir, wie Fliegen gezüchtet und mittels PCR auf Insertion einer Transaktivierungssequenz gescreent werden, die das erste Exon des zweiglosen Gens ersetzt.

- Wenn sich nos-Cas9-Embryonen, die zuvor sowohl mit dem Guide-RNA-Expressionsplasmid als auch mit dem Ersatzspender injiziert wurden, zu Erwachsenen entwickeln, werden Kreuz-G0-Fliegen einzeln von einer Linie aus gekreuzt, die für das Zielallel geeignet ist. Betäuben Sie die F1-Nachkommen aus jeder G0-Kreuzung auf einem Kohlendioxid-Pad und wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 bis 20 Männchen unter einem Stereomikroskop aus. Kreuzen Sie jedes ausgewählte Männchen einzeln mit einem Balancer-Weibchen von einer Linie, die für das Zielallel geeignet ist.

Wenn die F2-Larven schlüpfen, wählen Sie den F1-Vater aus jeder Kreuzung. Extrahieren Sie genomische DNA, indem Sie jede Fliege 10 bis 15 Sekunden lang mit einer Pipettenspitze mit 50 Mikrolitern Quetschpuffer zerquetschen, ohne den Puffer abzugeben. Geben Sie dann den restlichen Puffer in das Röhrchen und mischen Sie es gut.

Bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten inkubieren. Legen Sie die Röhrchen nach der Inkubation für 1 bis 2 Minuten in einen 95 Grad Celsius heißen Block, um die Proteinase K zu inaktivieren. Nach dem Herunterschleudern von 5 Minuten bei 10.000 g Gefrierfach lagern Sie das Präparat bei 4 Grad Celsius für die weitere PCR-Analyse.

Führen Sie dreistufige PCR-basierte Screenings mit den Primern vorwärts 1 und rückwärts 1 durch, um das Vorhandensein der Insertion oder des Ersatzes zu untersuchen. Führen Sie die PCR mit Forward-2- und Reverse-2-Primern durch, um die Insertion oder den Ersatz aus drei Prime-Regionen zu überprüfen. Führen Sie die PCR mit den Primern M13F und Reverse 3 durch, um die Enden-in-HDR zu überprüfen.

- Behalten Sie die Fliegenschnüre mit dem bestätigten Ends-Out-HDR bei und etablieren Sie Balance-Stocks aus der F2-Generation. Out cross the balancer fliegt erneut, um unbeabsichtigte Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen.