0 Aufrufe • 3:08 Min. • April 30th, 2023
- Um Fliegen für die Paraffineinbettung zu immobilisieren, schieben Sie betäubte Drosophila vorsichtig durch den Spalt eines Fliegenhalsbandes, so dass ihre Köpfe gleichmäßig auf dem Gerät positioniert sind, während sie noch mit dem Rest des Körpers verbunden sind. Legen Sie die Halsbänder zur Gewebefixierung in die Carnoy-Lösung. Carnoy's ist ein denaturierendes Fixiermittel, das aus Ethanol, Chloroform und Essigsäure besteht.
Um die Probe für die Paraffininfiltration vorzubereiten, dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie den Kragen durch abgestufte Ethanolkonzentrationen übertragen. Übertragen Sie dann den Kragen auf Methylbenzoat, ein organisches Lösungsmittel. Legen Sie es anschließend in ein Methylbenozoat und eine geschmolzene Paraffinlösung, während es erhitzt wird, um sicherzustellen, dass das Paraffin geschmolzen bleibt. Fahren Sie mit einer aufwendigen Reihe von Waschschritten nur mit vorgewärmtem Paraffin fort, um das Methylbenzoat zu entfernen.
Legen Sie dann den Kragen schnell in eine Form und gießen Sie geschmolzenes Paraffin, um ihn vollständig zu bedecken. Sobald das Paraffin ausgehärtet ist, entferne den Block aus der Form und benutze eine Rasierklinge, um überschüssiges Paraffin abzuschneiden. Brechen Sie den Kragen ab und lassen Sie die Reihe der eingelassenen Köpfe im Paraffinblock. Im Beispielprotokoll sehen wir das Verfahren, das für die Analyse neurodegenerativer Phänotypen demonstriert wird.
- Zu Beginn fädeln Sie die Fliegen am Hals mit einer Pinzette in die Kragen ein. Richten Sie alle Köpfe in der gleichen Ausrichtung aus und stellen Sie sicher, dass der Kopf oder die Augen nicht beschädigt werden. Fügen Sie augenlose Sinus-Oculis-Fliegen an zufälligen bekannten Positionen ein, damit die Reihenfolge der Fliegen in den Abschnitten leicht identifiziert werden kann. Wenn der interessierende Fliegenstamm helle oder weiße Augen hat, fädeln Sie rotäugige Fliegen in Abständen entlang des Streifens ein, um sicherzustellen, dass genügend Pigment vorhanden ist, um den Objektträger zu färben.
Notieren Sie die Reihenfolge der Fliegen zusammen mit der Halsbandnummer, wenn mehr als eine verwendet wird. Sobald ein Halsband fertig ist, legen Sie es für 3,5 bis 4 Stunden in die Lösung von Carnoy. Führen Sie eine Reihe von Ethanol-, Methylbenzoat- und Paraffinwaschungen durch, um das Fliegengewebe für die Einbettung vorzubereiten. Legen Sie dann die Manschetten in eine Gummi-Eiswürfelschale, eines pro Abschnitt.
Gießen Sie geschmolzenes Paraffin vorsichtig über die Kragen, vermeiden Sie Luftblasen und lassen Sie es über Nacht aushärten. Entfernen Sie die Paraffinblöcke mit den Manschetten aus dem Tablett. Trennen Sie den Paraffinblock mit einer Rasierklinge vom Halsband und brechen Sie den Kragen vorsichtig ab. Die Körper verbleiben im Kragen, während die Köpfe im Paraffinblock bleiben.