Der CApillary FEeder (CAFE) Assay: Eine Methode zur Verfolgung des Lebensmittelkonsums und der Präferenz bei Drosophila

- Zur Vorbereitung des Capillary Feeder oder CAFE-Assays führen Sie abgestufte oder markierte Glaskapillaren, die mit farbigen, flüssigen Lebensmitteln gefüllt sind, mit dem unteren Ende zuerst durch die Pipettenspitzen auf ein vormontiertes Versuchsfläschchen ein. Stellen Sie sicher, dass die Kapillaren sicher auf gleicher Höhe platziert sind und nicht mit dem Gerät in Berührung kommen.

Markieren Sie die Ausgangshöhe des Meniskus in jeder Kapillare. Lagern Sie die Fläschchen dann für die Dauer des Experiments in einer temperatur-, feuchtigkeits- und lichtkontrollierten Umgebung, während die Kapillaren bei Bedarf ausgetauscht werden. Während des CAFE-Assays sind die mobilen Fliegen nicht angeschnallt und haben freien Zugang zum unteren offenen Ende der Mikropipette. Fliegen fressen freiwillig, wenn sie ihren Rüssel ausstrecken und die Flüssigkeit aufnehmen, wodurch das Medium in der Kapillare reduziert wird.

Um den Nahrungskonsum und die Präferenz für einen bestimmten Zeitraum zu verfolgen, zeichnen Sie den Abstieg des Meniskus von der Anfangsmarkierung bis zu dem Niveau am Ende dieses Zeitraums aus qualifizierenden Kapillaren auf. Im Beispielprotokoll sehen wir den CAFE-Assay mit modifizierter Baugruppe, um eine reduzierte Verdampfung aus den flüssigkeitsgefüllten Kapillaren zu erreichen.

- Entfernen Sie vorsichtig die Pipettenspitze, die eine der äußeren Öffnungen verschließt, und führen Sie mit dem unteren Ende zuerst eine gefüllte Glaskapillare ein. Sichern Sie die Kapillare, indem Sie die Pipettenspitze wieder in die Nähe der Kapillare legen. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle getesteten Lebensmittellösungen.

Platzieren Sie dann die Kapillarenden in allen Fläschchen auf gleicher Höhe, 3 bis 4 Zentimeter vom Deckel entfernt. Lassen Sie etwas Abstand zwischen dem Filterpapier, um ein Auslaufen der Kapillare zu verhindern. Verwende einen Markierungsstift, um das obere Ende der farbigen Flüssigkeit zu beschriften. Beschriften Sie sie individuell mit einem Streifencode, um sicherzustellen, dass die verschiedenen Kapillaren identifiziert werden können.

Legen Sie die vorbereiteten CAFE-Assays in eine Kunststoffbox mit einem Gitter-Inlay. Verwenden Sie einen Schwammstopfen, um alle 24 Stunden 100 Mikroliter frisches Wasser aufzutragen, um die Luftfeuchtigkeit im Assay konstant zu halten. Verwenden Sie vier separate Fläschchen, die mit 30 Millilitern doppelt destilliertem H2O gefüllt sind, als Feuchtigkeitsmessgeräte und platzieren Sie sie neben den CAFE-Assays in der Kunststoffbox.

Decken Sie die Kunststoffbox ab, um während des Experiments eine feuchtigkeitskontrollierte Umgebung zu schaffen. Bringen Sie die Box für den Versuchszeitraum in eine sichere Position in einer temperatur-, licht- und feuchtigkeitsgesteuerten Klimakammer. Notieren Sie sich vor jedem 24-Stunden-Intervall die toten Fliegen und berechnen Sie anhand der Anzahl der lebenden Fliegen den Verbrauch pro Fliege für den folgenden Zeitraum.

Halten Sie den CAFE-Assay am Ende des Assays und vor dem Austausch der Kapillare in aufrechter Position. Nehmen Sie den Deckel nicht ab und markieren Sie den unteren Meniskus der Kapillare. Verwerfen Sie die Daten, wenn das Markierungsende nicht unter der ursprünglichen Markierung liegt. Ersetzen Sie die gebrauchten Kapillaren alle 24 Stunden durch frisch gefüllte Kapillaren für Langzeitexperimente.

Messen Sie den Rückgang des Meniskus. Entsorgen Sie dann die alten Kapillaren. Entfernen Sie dann vorsichtig die Kapillaren aus dem Assay und bewahren Sie sie für die Datenerfassung auf. Prüfen Sie, ob die Flüssigkeit in der Kapillare das untere Ende erreicht hat. Wenn die Flüssigkeit in der Kapillare das untere Ende nicht erreicht hat, verwerfen Sie die Daten.

Demontieren Sie nach dem Experiment den Aufbau und waschen Sie die Fläschchen, Deckel und Schwammstopfen in einem Seifenbad. Trocknen Sie sie dann über Nacht bei Raumtemperatur für die weitere Verwendung. Wiederholen Sie Experimente mit denselben Genotypen an mindestens drei verschiedenen Tagen. Messen Sie mit einem Messschieber den Abstand zwischen Markierungsanfang und Markierungsende auf der Kapillare. Entsorgen Sie abschließend die Kapillaren nach der Messung.