Bearbeitung von Insektenbeinen für die Fluoreszenzmikroskopie: Eine Methode zur Konservierung neuromuskulärer Strukturen für die Bildgebung

- Tauchen Sie anästhesierte Insekten zunächst in 70%ige Ethanollösung, um die Hydrophobie der Nagelhaut zu verringern. Waschen und permeabilisieren Sie das Gewebe dann mindestens 30 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die ein Reinigungsmittel enthält, um das Eindringen des Gewebes während der Fixierung zu ermöglichen.

Als nächstes entfernen Sie den Kopf und den Bauch vom Brustkorb. Üben Sie mit einer Pinzette leichten Druck auf den Coxa-Thorax-Übergang aus und lösen Sie das Bein. Legen Sie die Beine über Nacht vorsichtig in eiskalte 4%ige Paraformaldehydlösung, damit diese in das Gewebe eindringen kann. Paraformaldehyd repariert Gewebe, indem es Proteine vernetzt.

Entfernen Sie dann die Fixierlösung und waschen Sie das Tuch mehrmals mit phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmittel, das Reinigungsmittel enthält. Legen Sie die Beine vor dem Aufsteigen mindestens einen Tag lang in reinen oder leicht verdünnten Einbettpuffer, damit der Puffer genügend Zeit hat, in das Gewebe einzudringen.

Montieren Sie zum Schluss die Beine in einem Tropfen Einbettmedium. Verwenden Sie einen Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas, um eine Beschädigung der Probe zu verhindern, und befestigen Sie die Halterung mit Nagellack.

Im folgenden Beispiel sehen wir das Präparieren, Fixieren und Montieren von Drosophila melanogaster-Beinen.

- Beginnen Sie damit, die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in eine Multiwell-Glasplatte mit 70 % Ethanol zu füllen. Geben Sie mit einer Bürste 15 bis 20 Kohlendioxid-betäubte Fliegen jeden Alters und Geschlechts in jede Vertiefung und tupfen Sie die Fliegen vorsichtig in das Ethanol, bis sie vollständig untergetaucht sind.

Spülen Sie die Fliegen nach nicht mehr als einer Minute dreimal mit 0,3 % nichtionischer Tensidwaschlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für mindestens 10 Minuten pro Waschgang. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche mit einer Pinzette den Kopf und den Bauch jeder Fliege, ohne das Brustsegment oder die Beine zu beschädigen, und üben Sie mit der Spitze einer feinen Pinzette sanft, aber fest Druck auf den Coxa-Thorax-Übergang aus, um ein Bein vom Brustsegment zu lösen.

Legen Sie die Beine in eine Vertiefung einer neuen Multiwell-Platte, die frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd auf Eis enthält, für eine Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.

- Es ist wichtig, die Beine sanft in den Fixierungspuffer zu schieben, ohne sie schweben zu lassen, um gut fixierte Beine zu erhalten.

- Waschen Sie die Beine am nächsten Tag fünfmal 20 Minuten pro Waschgang in frischer 0,3%iger nichtionischer Tensidwaschlösung. Ersetzen Sie nach der letzten Wäsche das Reinigungsmittel durch Eindeckmedium und bewahren Sie die Beine mindestens 24 Stunden lang im Eindeckmedium auf.

Geben Sie am nächsten Tag etwa 20 Mikroliter 70%iges Glycerin neben das beschichtete Ende des Glasobjektträgers und bedecken Sie das Glycerin mit einem 22 x 22 Millimeter großen Deckglas. Geben Sie dann etwa 10 Mikroliter Eindeckmittel rechts neben dem Deckglas hinzu und tragen Sie eine zweite 30-Mikroliter-Linie Eindeckmittel rechts von der 10-Mikroliter-Linie auf.

Übertragen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schenkel von der Multiwell-Platte in einem Tropfen Medium auf den 10-Mikroliter-Streifen mit Eindeckmedium in einer äußeren Ausrichtung nach oben oder unten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sechs bis acht Beine montiert und ausgerichtet sind, und legen Sie ein zweites Deckglas so über die Beine, dass das zweite Deckglas leicht auf dem ersten Deckglas aufliegt. Verwenden Sie dann Nagellack an jeder Ecke der Deckgläser, um sie an Ort und Stelle zu befestigen.