Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

- Bei der erwachsenen Fliege sind die indirekten Flugmuskeln (IFMs) die größten Muskeln der Fliege, die den gesamten Brustkorb überspannen. Die IFMs orchestrieren die charakteristischen hochfrequenten Flügelbewegungen bei zweiflügeligen Fliegen, einschließlich Drosophila. Zwei gegensätzliche Muskelfasergruppen bilden die IFMs.

Zunächst befinden sich die dorsalen Längsmuskeln (DLMs) entlang der Medianebene des Thorax über dem Darm und erstrecken sich von anterior nach posterior. Zweitens erstrecken sich die dorsalen ventralen Muskeln (DVMs) von der Oberseite bis zur Unterseite des Brustkorbs und werden vom TDT oder Sprungmuskel flankiert. Beide Muskelgruppen sind an der Nagelhaut befestigt.

Etwa 48 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) können reifende IFMs mit einem einfachen Dissektionsmikroskop visuell identifiziert werden. Im Beispielprotokoll werden wir IFMs von Puppen sammeln, die älter als 48 Stunden APF sind, für die Hochdurchsatzanalyse.

- Für die IFM-Dissektion nach 48 Stunden APF verwenden Sie einen leicht angefeuchteten Pinsel, um die inszenierten Puppen auf einen Streifen doppelseitiges Klebeband zu übertragen, der auf einem Objektträger befestigt ist. Richten Sie die Puppen in einer Linie aus, mit der Bauchseite nach unten und anterior zum unteren Rand des Objektträgers. Wenn alle Puppen platziert sind, verwenden Sie eine Pinzette, um die erste Puppenhülle über den vorderen Puppen auseinander zu ziehen und zu öffnen, und schieben Sie vorsichtig eine Pinzette nach hinten in Richtung der hinteren und schneiden Sie die Puppenhülle durch, während sich die Pinzette bewegt.

Befreien Sie die Puppe aus dem geöffneten Gehäuse und geben Sie die Puppe sofort in einen Tropfen PBS auf einem zweiten Objektträger. Wenn alle Puppen befreit sind, schneiden Sie mit einer feinen Schere den Hinterleib der Puppen vom Brustkorb ab und schieben Sie den Bauch in einen separaten Haufen. Wenn alle Thoraxe entfernt wurden, verwenden Sie ein Stück Seidenpapier, um den Großteil des PBS und den Bauchhaufen zu entfernen.

Geben Sie einen Tropfen frisches, gekühltes PBS zu den restlichen Thoraxen, bevor Sie mit der Schere den Kopf entlang der Körperlängsachse in einer einzigen Bewegung abschneiden, um den Thorax in zwei Hälften zu teilen. Wenn alle Puppen präpariert wurden, wählen Sie mit der Pinzette Nummer fünf eine der Hemisektionen aus und führen Sie die Spitzen einer Pinzette vorsichtig über und unter der Mitte der IFMs ein.

Halten Sie die erste Pinzette ruhig und schneiden Sie mit einer feinen Schere ein Ende der IFM von der Nagelhaut und den Sehnen weg, bevor Sie die Puppe um 180 Grad drehen, damit das andere Ende der IFM von der Nagelhaut und den Sehnen befreit werden kann. Verwenden Sie eine Pinzette, um das IFM-Bündel mit Wasserspannung vom Thorax an den Rand der PBS-Blase zu übertragen, um das Bündel an Ort und Stelle zu halten.

Schieben Sie dann den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite des Objektträgers und zerlegen Sie den Rest der IFMs auf die gleiche Weise. Wenn alle IFMs entnommen wurden, verwenden Sie die Pinzette Nummer fünf, um alle Sprungmuskel- oder Nagelhautfragmente zu entfernen, die möglicherweise ihren Weg in die Proben gefunden haben. Fangen Sie dann die präparierten IFMs vorsichtig zwischen einer Pinzette auf und legen Sie die IFMs in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 Mikrolitern gekühltem PBS.