JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 Ansichten • 2:56 Min. • April 30th, 2023
- Übertragen Sie gewaschene C. elegans in Flüssigkeit auf einen Objektträger, der zuvor mit Polylysin beschichtet war, einer Verbindung, die die Wurmhaut an der Glasoberfläche haften lässt. Drücken Sie einen anderen Objektträger vorsichtig gerade nach unten, wobei eine Kante über den unteren Objektträger hinausragt. Um die Würmer ohne Beschädigung ruhigzustellen, komprimieren Sie die Tiere und vermeiden Sie dabei seitliche Bewegungen. Legen Sie dann die Objektträger mit den eingeklemmten Würmern auf einen Metallblock in einen isolierten Laborbehälter, der mit einem Gefriermittel wie flüssigem Stickstoff oder Trockeneis gefüllt ist.
Metall ist ein effektiver Temperaturleiter, der sicherstellt, dass die Blockoberfläche kalt genug ist, um die Nagelhaut des Wurms schnell an beiden Glasoberflächen zu gefrieren. Sobald sie eingefroren sind, trenne die Objektträger schnell, um die Nagelhaut des Wurms auseinander zu ziehen oder aufzubrechen. Fahren Sie mit der Gewebefixierung und -färbung fort, da die Störung der Nagelhaut mit geringer Permeabilität chemischen Fixiermitteln und Färbeantikörpern den Zugang zum inneren Wurmgewebe ermöglicht. Im folgenden Protokoll sehen wir eine detaillierte Demonstration der Freeze-Cracking-Technik und der Gewebefixierung.
- Bereiten Sie zunächst eine Folie vor, um die Würmer zu fixieren. Pipettieren Sie 30 Mikroliter Poly-L-Lysin auf einen Objektträger, setzen Sie dann einen zweiten Objektträger auf den anderen und reiben Sie sie aneinander, um die Lösung gleichmäßig auf beiden zu verteilen. Schälen Sie nun die beiden Objektträger auseinander und lassen Sie sie 30 Minuten an der Luft trocknen.
Legen Sie als Nächstes einen flachen Metallblock in einen Behälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Waschen Sie die Platten mit M9-Lösung und übertragen Sie etwa 10 Mikroliter M9, das die Würmer enthält. Alternativ können Sie die Würmer auswählen und M9 zur Folie hinzufügen.
Sobald die Würmer übertragen sind, lassen Sie ein Deckglas vorsichtig quer über sie fallen, so dass das Deckglas über eine Kante hinausragt. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Deckglas, ohne seitliche Bewegungen zu machen.
Übertragen Sie nun den Objektträger sofort in flüssigem Stickstoff auf den Metallblock und lassen Sie ihn einfrieren. Nach fünf Minuten schnippen Sie das Deckglas mit der überhängenden Kante ab. Tun Sie dies schnell, um den richtigen Riss der Nagelhaut zu erhalten.
Tauchen Sie die Rutsche anschließend bei minus 20 Grad Celsius in ein mit Methanol gefülltes Coplin-Glasgefäß. Nach fünf Minuten den Objektträger für weitere fünf Minuten bei gleicher Temperatur in ein mit Aceton gefülltes Coplin-Glas geben. Die Objektträger können direkt gebeizt oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.