C. elegans Gonadenextrusion: Eine schnelle Dissektionstechnik

- In einem Röhrchen mit M9-Puffer werden bis zu 150 Hermaphroditenwürmer im gewünschten Entwicklungsstadium gesammelt. Entfernen Sie Bakterien von den Würmern, indem Sie sie mit M9-Puffer waschen und zentrifugieren.

Betrachten Sie das Röhrchen unter einem Präpariermikroskop, wenn Sie den Überstand entfernen, um Probenverluste zu vermeiden. Übertragen Sie die Würmer in eine Glasschale mit einem minimalen Volumen M9-Puffer. Fügen Sie Levamisol hinzu, um die Würmer zu betäuben.

Lokalisiere den Kopf des Wurms und den Rachen oder Vorderdarm, der zwei zwiebelförmige Strukturen enthält. Mit zwei Nadeln habe ich den Wurm hinter dem Rachen durchtrennt. Stellen Sie sicher, dass Sie die Dissektion schnell abschließen, um eine Beeinträchtigung des Gewebes zu vermeiden.

Sobald die Kutikula aufgebrochen ist, werden die beiden Keimdrüsenarme durch den Innendruck des Wurms extrudiert oder aus dem Körper herausgedrückt.

In diesem Beispiel werden wir Gonaden von adulten Würmern für die Immunfluoreszenzanalyse präparieren.

- Entnehmen Sie 100 bis 150 Würmer im gewünschten Entwicklungsstadium und sammeln Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern M9-Puffer. Füllen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit weiteren 900 Mikrolitern M9-Puffer und zentrifugieren Sie es bei 1.000 mal g für 1 Minute bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig 900 Mikroliter des M9-Puffers. Wiederholen Sie dann die Wäsche noch zwei weitere Male, um die meisten anhaftenden Bakterien zu entfernen.

Übertragen Sie anschließend die Würmer mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit erweiterter Bohrung in 100 Mikroliter M9-Puffer in eine Glasschale mit flachem Boden. Geben Sie dann 1 bis 3 Mikroliter 0,1 molare Levamisol in die Schüssel und schwenken Sie es vorsichtig. Befestigen Sie nun zwei 25-Gauge-Nadeln an zwei Spritzen, um ein Präparierwerkzeug für jede Hand herzustellen.

Positionieren Sie unter einem Präpariermikroskop jede Nadel unter und über jedem Wurm und machen Sie mit einer scherenartigen Bewegung einen feinen Schnitt an jedem Wurm in der Nähe des zweiten Rachenkolbens. Schneiden Sie alle Tiere mindestens einmal innerhalb von fünf Minuten, damit das Levamisol wirksam bleibt.

- Es ist sehr wichtig, dass das Sezieren der Tiere in der Schale in weniger als fünf Minuten abgeschlossen ist.

- Falls eine extrudierte Gonade nicht sichtbar ist, überspringen Sie einfach das Tier. Hier sind ordentlich extrudierte Gonaden sichtbar.