0 Aufrufe • 2:44 Min. • April 30th, 2023
- Lassen Sie für die PCR-Analyse eines einzelnen Wurms einen Hermaphroditen sich selbst befruchten und Eier legen, die genetisch identische Nachkommen hervorbringen, und bewahren Sie daher eine Kopie des modifizierten Stammes auf. Übertragen Sie dann das Elternteil in ein Röhrchen mit Wurmlysepuffer.
Frieren Sie die Tube bei minus 80 Grad Celsius ein, um die Nagelhaut oder die äußere Schicht aufzubrechen. Erhitzen Sie die Probe auf plus 60 Grad Celsius, um die Wurmzellen zu lysieren und die intrazellulären Proteine zusammen mit der genomischen DNA der Zelle freizusetzen. Bei dieser Temperatur baut die Proteinase K im Puffer die Proteine ab, insbesondere die Nukleasen, die sonst die genomische DNA zerstören würden.
Erhöhen Sie dann die Temperatur auf 95 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Geben Sie schließlich das Zelllysat in ein Röhrchen mit einem PCR-Mastermix, der aus Reaktionspuffer, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimern für die interessierende Region, Taq-Polymerase und Wasser besteht, um die Reaktion auf ein gewünschtes Endvolumen zu bringen. Um die PCR durchzuführen, führen Sie das entsprechende Thermocycler-Programm aus, das die interessierende DNA-Region amplifiziert.
Im folgenden Beispiel sehen wir ein PCR-Verfahren zum Screening auf CRISPR-Cas9-Editierungsereignisse in der genomischen DNA einzelner F1-Würmer.
- Nach 1 bis 2 Tagen Eiablage verwenden Sie ein Wurmbild, um die F1s in einzelne PCR-Streifenröhrchenkappen mit 7 Mikrolitern warmem Lysepuffer zu übertragen. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur, um die Tiere auf den Boden des Röhrchens zu bringen. Frieren Sie die Röhrchen dann eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius ein.
Als nächstes lysieren Sie gefrorene Würmer in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm. Richten Sie dann einen PCR-Mastermix ein, wie in dieser Tabelle gezeigt.
Geben Sie 21 Mikroliter PCR-Mastermix in saubere PCR-Röhrchen. Fügen Sie dann 4 Mikroliter des Wurmlyseröhrchens hinzu und mischen Sie es gut durch Pipettieren.
Führen Sie dann das PCR-Programm gemäß den Richtlinien des Herstellers durch.