Einzelwurm-PCR: Eine Methode zur Extraktion und Amplifikation genomischer DNA

- Lassen Sie für die PCR-Analyse eines einzelnen Wurms einen Hermaphroditen sich selbst befruchten und Eier legen, die genetisch identische Nachkommen hervorbringen, und bewahren Sie daher eine Kopie des modifizierten Stammes auf. Übertragen Sie dann das Elternteil in ein Röhrchen mit Wurmlysepuffer.

Frieren Sie die Tube bei minus 80 Grad Celsius ein, um die Nagelhaut oder die äußere Schicht aufzubrechen. Erhitzen Sie die Probe auf plus 60 Grad Celsius, um die Wurmzellen zu lysieren und die intrazellulären Proteine zusammen mit der genomischen DNA der Zelle freizusetzen. Bei dieser Temperatur baut die Proteinase K im Puffer die Proteine ab, insbesondere die Nukleasen, die sonst die genomische DNA zerstören würden.

Erhöhen Sie dann die Temperatur auf 95 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Geben Sie schließlich das Zelllysat in ein Röhrchen mit einem PCR-Mastermix, der aus Reaktionspuffer, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimern für die interessierende Region, Taq-Polymerase und Wasser besteht, um die Reaktion auf ein gewünschtes Endvolumen zu bringen. Um die PCR durchzuführen, führen Sie das entsprechende Thermocycler-Programm aus, das die interessierende DNA-Region amplifizie