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- Bei der Visualisierung von Lipidtröpfchen, den intrazellulären Speicherorganellen für neutrale Lipide, beginnen Sie mit der Zugabe einer Waschmittellösung, z. B. einer mit Triton X-100, in die Probe. Dadurch werden die Zellen des Wurms permeabilisiert. Fixieren Sie anschließend die Probe in der entsprechenden Konzentration von Isopropanol, z. B. 40 %.
Geben Sie dann Nilrot in die Probe und schützen Sie sie vor Licht, da der Farbstoff lichtempfindlich ist. Die Fixierung ermöglicht es dem Farbstoff, auf Lipidtröpfchen im gesamten Tier zuzugreifen. Nilrot ist ein lipophiler Farbstoff, dessen Fluoreszenzemissionsspektrum von der Polarität der lokalen Lipidumgebung abhängt.
Bei Exposition gegenüber polaren Lipiden wie Phospholipiden liegt das Emissionsspektrum von Nilrot in den höheren, roten Wellenlängen. Wenn es neutralen Lipiden wie Triacylglycerinen und Sterolestern im neutralen Kern von Lipidtröpfchen ausgesetzt wird, verschiebt sich das Emissionsspektrum von Nilrot in die unteren Gelbgoldwellenlängen.
Verwenden Sie daher den grünen Kanal eines Fluoreszenzmikroskops, das die gelb-goldenen Wellenlängenemissionen sammelt, um die Nilrot-Färbung von Lipidtröpfchen im gesamten Tier sichtbar zu machen. Im Beispielprotokoll sehen wir ein Nilrot-Färbeverfahren und die Bildgebung von Lipidtröpfchen in fixierten Proben.
- Um die Nilrot-Lipidfärbung durchzuführen, werden die Würmer auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) mit spätem log OP50 E. coli ausgesät und die Würmer bei 20 Grad Celsius bis zum frühen L4-Stadium gezüchtet. Waschen Sie die Würmer mit 1 Milliliter PBST-Lösung und geben Sie die Wurmsuspension in ein 1,5 Milliliter Mikrofuge-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft, entfernen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die PBST-Wäsche, bis die E. coli aus der Suspension entfernt ist. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 40 % Isopropanol oder 60 % für die ORO-Färbung in das Wurmpellet und inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Die Zugabe von Isopropanol ist entscheidend für die richtige Permeabilisierung der Würmer vor der Färbung.
- Zentrifugieren Sie die Würmer eine Minute lang bei der 560-fachen Schwerkraft und entfernen Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu beschädigen.
- Es ist wichtig, die Lichteinwirkung während der Zentrifugationsschritte zu minimieren.
- Geben Sie nun im Dunkeln 600 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NR-Arbeitslösung zu jeder Probe. Drehen Sie die Röhrchen dreimal um und mischen Sie die Würmer und die Lösung vollständig. Dann inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation die Würmer zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie dann 600 Mikroliter PBST hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln, um den überschüssigen NR-Fleck zu entfernen. Nachdem die Proben erneut wie zuvor gedreht wurden, werden alle bis auf etwa 50 Mikroliter Überstand entfernt.