RNAi-Plating für die Fütterung von C. elegans: Eine Technik zur Induktion der Ziel-dsRNA-Expression in E. coli

- In C. elegans kann RNAi induziert werden, indem Wurmbakterien gefüttert werden, die doppelsträngige RNA oder dsRNA aus einem rekombinanten DNA-Plasmid exprimieren.

Zu Beginn züchten Sie Tetracyclin-resistente HT115 E. coli, die über Nacht mit L4440-Plasmid transfiziert wurden, auf selektiven LB-Agarplatten, die Tetracyclin und Ampicillin oder sein funktionelles Analogon Carbenicillin enthalten. Das Plasmid enthält neben der Ziel-DNA ein Gen für die Ampicillin-Resistenz. Nur Bakterienkolonien, die das Plasmid erben, können in Gegenwart dieser Antibiotika wachsen.

Ernten Sie anschließend Bakterienkolonien und expandieren Sie diese in flüssigem LB-Medium auf die gewünschte Konzentration. Um die dsRNA-Expression zu induzieren, übertragen Sie die Bakterienlösung auf vorbereitete Nematoden-Wachstumsmedien (NGM), die IPTG enthalten.

In diesem Expressionssystem ahmt IPTG Laktose nach, um den lac-Repressor zu inaktivieren und so die Expression der T7-RNA-Polymerase zu ermöglichen. Auf dem Plasmid wird die Expression der Ziel-DNA durch zwei konvergente T7-Promotoren reguliert. Folglich werden Sense- und Anti-Sense-Sequenzen transkribiert, die zur Expression von dsRNA führen.

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