Drosophila Y-Labyrinth-Assay: Eine Methode zur Beurteilung von Geruchsreaktionen bei Fliegen

- Ein Y-Labyrinth besteht aus einem Y-förmigen Verbinder mit drei Fliegenfläschchen, die durch gerade oder konische Rohre miteinander verbunden sind. Fliegen bewegen sich durch das Labyrinth zur Seite mit dem Reiz, den sie bevorzugen. Um das Experiment zu starten, legen Sie ein Seidenpapier mit der Lösung mit den flüchtigen Chemikalien in jedes Fläschchen. Verbinden Sie sie dann mit den konischen Rohren. Die sich verjüngenden Röhren begrenzen die Fähigkeit der Fliegen, in die Mitte des Labyrinths zurückzukehren, und verlangsamen die Diffusion der flüchtigen Chemikalien.

Als nächstes kältehungrige Fliegen, um sie zu verlangsamen. Verwenden Sie keine chemische Betäubung, da dies das Ergebnis des Assays beeinflussen kann. Verbinde das Fläschchen mit den gekühlten Fliegen schnell mit der letzten Seite des Labyrinths. Lassen Sie die Fliegen das Labyrinth erkunden. Um die Bevorzugung durch helles Licht zu verringern, führen Sie diesen Schritt unter dunkelrotem Licht durch, das Fliegen nicht sehen. Zum Schluss zählst du die Fliegen auf jeder Seite des Labyrinths. Ihre Lage im Labyrinth deutet darauf hin, dass sie diesen flüchtigen chemischen Geruch bevorzugen.

Im Beispielprotokoll sehen wir einen Aufbau des Y-Labyrinth-Assays mit Wildtyp Drosophila.

- Vor der Durchführung des Assays am nächsten Morgen am Ende des Tages Kohorten von 10 bis 20 Versuchslinien mit Feuchtigkeit aus einem feuchten Handtuch in Glasfläschchen umfüllen. Die Fliegen müssen innerhalb von 16 bis 18 Stunden getestet werden, sonst könnten sie durch Austrocknung oder Hunger sterben. Am nächsten Tag baust du das Y-Labyrinth zusammen. Beginnen Sie damit, den Y-förmigen Verbinder mit zwei Glasfläschchen zu verbinden, indem Sie Schaumstoffverbinder mit abgeschnittenen Pipettenspitzen verwenden, aus denen die Leitungen bestehen. Ihre sich verjüngende Form macht diese Einbahnstraßen zu Durchgängen.

Der dritte Zweig des "Y" ist an einem Laderohr befestigt, das aus dem großen Teil einer Pipettenspitze besteht, und ermöglicht den Durchgang vom Ladefläschchen zum Wahlpunkt des Labyrinths. Hinter jedem sich verjüngenden Tunnel befindet sich ein Glasfläschchen, von dem eines mit einem Odormittel beladen werden muss. Legen Sie diese als 40-Mikroliter-Boli ein, die in 28-Millimeter-Quadrate Seidenpapier getränkt sind. Welche der beiden den Odorant enthält, sollte sich nach dem Zufallsprinzip abwechseln.

Um den Test durchzuführen, kühlen Sie die Fliegen zunächst kurz auf Eis ab, damit die Fliegen abgebremst werden. Dies sollte unter dunkelrotem Licht von LED-Lampen und bei 25 Grad Celsius geschehen. Lassen Sie die Fliegenkohorte vorsichtig in das Ladefläschchen fallen und beladen Sie das Y-Labyrinth mit den Testfliegen. Verwenden Sie keine Gasanästhesie.

- Es ist wirklich wichtig, die Fliegen sowohl schnell als auch schonend in das Ladefläschchen zu bringen. Es ist eigentlich der schwierigste Schritt dieses Experiments, denn Fliegen müssen schnell aufwachen, bevor sich die Gerüche im Y-Labyrinth verbreiten.

- Die Fliegen sollten das Labyrinth 24 Stunden lang erkunden dürfen, so dass sich eine maximale Anzahl an Fliegen zu dem ein oder anderen Glasfläschchen bewegt. Die Anzahl der in den verschiedenen Röhren vorhandenen Fliegen dient zur Berechnung des Geruchsindex. Auf diesen Wert sollten statistische Standardmethoden angewendet werden, die aus dem Verhalten von bis zu 10 Fliegen gewonnen werden.

Wenn 10-Fliegen-Kohorten keine konsistenten Ergebnisse liefern, können die Versuche mit 20-Fliegen-Kohorten durchgeführt werden. Um die Labyrinthkomponenten zu reinigen, weichen Sie sie zerlegt über Nacht in RBS 35 MD ein. Spülen Sie anschließend mit Leitungswasser und spülen Sie es abschließend mit DI-Wasser, bevor Sie an der Luft trocknen.