0 Aufrufe • 5:51 Min. • April 30th, 2023
- Sammeln Sie lebende Drosophila-Embryonen und entfernen Sie ihre undurchsichtigen Chorionen. Tragen Sie dann auf ein Glasdeckglas eine Linie Heptankleber auf, bei dem es sich um Klebeband handelt, der in flüssigem Heptan gelöst ist. Um mit den nun dechorionierten Embryonen umgehen zu können, richten Sie die Proben vorsichtig in einer Reihe auf dem Klebstoff aus.
Übertragen Sie das Deckglas in eine Dehydrationskammer, um die Embryonen teilweise auszutrocknen. Dadurch wird ein zytoplasmatisches Austreten während oder nach der Injektion verhindert. Entfernen Sie anschließend das Deckglas und bedecken Sie die Embryonen mit Halogenkohlenwasserstofföl, um eine weitere Dehydrierung zu verhindern, während der Sauerstoff weiterhin in die Embryonen diffundieren kann.
Um die Mikroinjektion durchzuführen, verwenden Sie ein Mikroinjektionssystem an einem kompatiblen Mikroskop. Indem Sie durch die Augenteile schauen, identifizieren Sie sowohl die Embryonen als auch die mit der Injektionslösung vorgeladene Nadel. Brechen Sie die Nadel auf und stellen Sie sicher, dass sie gleichmäßige und richtig große Flüssigkeitstropfen produziert. Führen Sie dann die Nadel in den Embryo ein und injizieren Sie das entsprechende Volumen. Holen Sie die Nadel heraus und fahren Sie mit der nächsten fort, wobei Sie die Injektion für die verbleibenden Embryonen wiederholen.
Im Beispielprotokoll sehen wir eine Demonstration der Mikroinjektion von Drosophila-Embryonen für Live-Bildgebungsstudien der Zellteilung.
- Bevor Sie das Deckglas anbringen, stellen Sie Heptankleber her, indem Sie das doppelte Klebeband abrollen und in eine 100-Milliliter-Flasche legen. Fügen Sie etwa 50 Milliliter Heptan hinzu, verschließen Sie die Flasche und wiegen Sie sie mehrere Tage lang.
Bevor Sie die Embryonen vorbereiten, machen Sie eine Dehydrationskammer, in die die Embryonen vor der Injektion gelegt werden. Dazu legst du einen Teil einer 35-Millimeter-Schale in eine 100-Millimeter-Petrischale, um einen "Tisch" zu machen. Drierit, das wasserfreies Calciumsulfat ist, so hinzufügen, dass die Höhe des Drierits nicht höher als die "Tabelle" ist, und abdecken.
Um mit der Vorbereitung der Embryonen zu beginnen, entnehmen Sie sie zuerst aus dem Legekäfig, indem Sie die Traubensaftplatte stündlich mit Hefe wechseln. Die Embryonen sollten etwa zwei Stunden nach Beginn der Entnahme abgebildet werden. Um das Deckglas vorzubereiten, legen Sie es auf eine Seite eines Objektträgers und kleben Sie die vier Ecken fest, damit es sich nicht bewegt.
Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze eine Schicht Heptankleber in einer Linie auf das Deckglas auf. Der Kleber sollte nicht zähflüssig sein und in wenigen Sekunden trocknen. Wenn es zu dickflüssig ist, füge mehr Heptan hinzu.
Zum Schluss kleben Sie ein Stück doppeltes Klebeband auf die Folie neben dem Deckglas. Nehmen Sie die Embryonen mit einer angefeuchteten Bürste vorsichtig von der Traubensaftplatte auf und legen Sie sie auf das Doppelklebeband auf dem Objektträger.
Als nächstes rollen Sie die Embryonen mit einer Pinzette über das doppelt klebende Klebeband, bis das Chorion aufbricht. Nehmen Sie den Embryo auf, indem Sie ihn vorsichtig über das Chorion rollen, so dass er an der Pinzette haftet, und legen Sie ihn auf den Heptankleber auf dem Deckglas, wobei die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Deckglases verläuft.
Setzen Sie 10 bis 20 Embryonen in eine Reihe. Entfernen Sie das Deckglas und legen Sie es für drei bis acht Minuten in die Dörrkammer. Die Zeit hängt von der lokalen Luftfeuchtigkeit und der zu injizierenden Menge ab. Legen Sie anschließend das Deckglas auf eine Metallkammer mit Vakuumfett. Zum Schluss bedecken Sie die Embryonen mit Halogenkohlenwasserstofföl, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden. Die Embryonen sind nun bereit für die Injektion.
Zuerst finden Sie die Embryonen unter einem 16-fachen Ziel. Bewegen Sie die Embryonen weg und finden Sie die Nadel, ohne die Brennebene zu bewegen. Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in X- oder Y-Richtung zu bewegen.
Um die Nadel zu öffnen, legen Sie die Kante des Deckglases in das Sichtfeld, aber nicht an die Stelle, an der sich eine Nadel befindet, und senken Sie die Nadel auf die gleiche Brennebene. Bewegen Sie das Deckglas sehr vorsichtig, bis es auf die Nadel trifft und sie vorsichtig aufbricht. Bewegen Sie die Nadel nach oben.
Bringen Sie nun die Embryonen ins Blickfeld. Senken Sie die Nadel in das Öl und achten Sie darauf, dass Sie schöne Flüssigkeitstropfen aus der Nadel erhalten. Bewegen Sie den Embryo gleichmäßig in die Nadel, injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo dann weg. Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sind sie bereit für die Betrachtung an einem konfokalen Mikroskop mit einem 60- oder einem 100X-Objektiv.