Drosophila Activity Monitor (DAM): Eine Methode zur Messung der Bewegungsaktivität bei Fliegen

- Der Drosophila Activity Monitor (DAM) hält zentrierte Aktivitätsröhren, die an einem Ende mit Fliegenfutter und am anderen Ende mit einem luftdurchlässigen Verschluss ausgestattet sind. Dieser Aufbau bietet Platz für einzelne Fliegen während mehrtägiger oder sogar wochenlanger Experimente.

Platzieren Sie das DAM in einer kontrollierten Umgebung wie einem Inkubator mit eingestellter Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtzyklus. Führen Sie das Experiment in einem dunklen Raum durch und verwenden Sie gegebenenfalls eine Infrarotlichtquelle, um das Gerät zu handhaben, das im Gegensatz zu hellem Licht das zirkadiane System der Fliege nicht beeinflusst.

Um die Bewegungsaktivität aufzuzeichnen, schließen Sie das Gerät an ein Computersystem an, das die Messwerte der DAM-Detektoren speichert. Die Elektronik des DAM erkennt kontinuierlich die Integrität eines Infrarotstrahls, der durch den Mittelpunkt jeder Röhre emittiert wird, und lädt in regelmäßigen Abständen Daten an das Computersystem hoch.

Während die Fliege in der Röhre hin und her läuft, kreuzt sie den Infrarotstrahl. Diese Unterbrechungen werden vom DAM über die Zeit für jede Röhre gezählt und dienen als Maß für die Fliegenaktivität.

Im folgenden Protokoll werden wir das DAM-System verwenden, um zirkadiane Rhythmen bei erwachsenen Drosophila-Männchen zu untersuchen.

- Schalten Sie vor dem Laden der Fliegen in die Aktivitätsröhren die Inkubatoren ein, in denen die Aktivitätsmonitore untergebracht werden. Passen Sie die Temperatur mit der Steuerung des Inkubators an und stellen Sie das Hell-Dunkel-Regime mit dem Lichtregler des DAM-Systems oder der eigenen Lichtsteuerung des Inkubators entsprechend dem gewünschten Versuchsdesign ein.

Als nächstes betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Übertragen Sie dann mit einem feinen Pinsel vorsichtig eine einzelne Fliege in eine Aktivitätsröhre. Nehmen Sie die Mitte eines einzelnen Garnstücks, das etwa einen halben Zoll lang ist, mit einer feinen Pinzette und führen Sie das Garn in das Non-Food-Ende des Aktivitätsschlauchs ein, um die Öffnung zu verschließen und zu verhindern, dass die Fliege während des Experiments entweicht, während Sie gleichzeitig einen Luftstrom in den Schlauch ermöglichen.

Halten Sie den Schlauch auf die Seite, bis die Fliege erwacht, um zu verhindern, dass die Fliege am Futter hängen bleibt. Stecken Sie die Schläuche in die Aktivitätsmonitore. Bei dem neueren, kompakteren Modell der TriKinetics Monitore ist es notwendig, die Röhren mit Gummibändern an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass der Infrarotstrahl die Röhre in der Mittelposition passiert.

Setzen Sie abschließend die Aktivitätsmonitore in die Inkubatoren ein und schließen Sie sie über die Telefonkabel an das Datenerfassungssystem an. Überprüfen Sie mit der DAM-Systemerfassungssoftware, ob alle Monitore ordnungsgemäß angeschlossen sind und dass Daten von jedem von ihnen gesammelt werden.

Nachdem die Fliegen in die Aktivitätsröhren geladen wurden und das System zur Überwachung der Bewegungsaktivität bereit ist, können die Daten nun aufgezeichnet werden. Fliegen werden synchronisiert und mitgerissen, indem sie zwei bis fünf volle Tage lang dem gewünschten Hell-Dunkel- (LD) und Temperaturregime ausgesetzt werden. Die am häufigsten verwendete Entrainment-Bedingung ist ein Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden Hell/12 Stunden Dunkelheit bei 25 Grad Celsius.

Für die Untersuchung der zirkadianen Rhythmen in Bezug auf dieses Protokoll wird die Zeit, zu der das Licht im Inkubator angeht, als Zeitgeberzeit 0 definiert, und alle anderen Zeiten sind relativ zu diesem Wert. Unter Standardbedingungen von 12:12 LD zeigen Wildtyp-Drosophila melanogaster typischerweise zwei Aktivitätsschübe; eine um ZT0 zentriert, die als Morgenspitze bezeichnet wird, und eine andere um ZT12, die als Abendspitze bezeichnet wird.

Freilaufende Bewegungsrhythmen werden unter konstanten Dunkelheits- und Temperaturbedingungen nach der Einschulungszeit gemessen. Die Einstellung für den Lichtzyklus kann jederzeit in der Dunkelphase am letzten Tag der LD geändert werden, so dass der folgende Tag des Experiments den ersten Tag der DD darstellt. Sieben Tage der DD-Datenerfassung reichen aus, um die zirkadiane Periode und die Amplitude bzw. Stärke des Rhythmus der Fliegen zu berechnen.

Im Allgemeinen ist eine Stichprobengröße von mindestens 16 Fliegen notwendig, um zuverlässige Freilaufzeiten für einen bestimmten Genotyp zu erhalten. Am Ende des Experiments werden die mit der DAM-Systemsoftware gesammelten binären Rohdaten auf ein tragbares Datenspeichergerät, z. B. einen USB-Stick, heruntergeladen.

Die binären Rohdaten werden mit DAM Filescan102X verarbeitet und bei der Analyse von zirkadianen Parametern in 15- und 30-Minuten-Bins oder bei der Analyse von Schlaf-/Ruheparametern in 1- bis 5-Minuten-Bins summiert. Derzeit sind fünf zusammenhängende Minuten Inaktivität die Standarddefinition von Schlaf/Ruhe bei Drosophila.