0 Aufrufe • 3:06 Min. • April 30th, 2023
- Entfernen Sie zunächst den Kopf einer betäubten erwachsenen Fliege. Decken Sie die enthauptete Fliege mit einer Lösung ab, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Rinderserumalbumin (BSA) enthält, um ein Austrocknen zu vermeiden. Halten Sie die Fliege mit einer Pinzette am Brustkorb fest und ziehen Sie dann mit einer zweiten Pinzette am Bauch, um den Darm freizulegen. Da der Kropf oder der Vorratssack am Brustkorb befestigt wird, ziehen Sie den Darm vorsichtig vom Brustkorb weg.
Sobald Du sie gelöst hast, ziehst Du die Gerte vom Bauch weg, um den Darm zu entfalten. Ziehe das hintere Ende der Fliege ab, um den Darm aus der Bauchhöhle zu befreien. Ziehe weiter am Darm, um das gesamte Gewebe aus dem Bauch zu ziehen. Nach der Befreiung entfernen Sie den Vorderdarm, die Malpigh'schen Tubuli, den Hinterdarm und die Eierstöcke, um nur den präparierten Mitteldarm zu hinterlassen, den primären Ort der Verdauung in der Fliege.
Im Beispielprotokoll werden wir den Mitteldarm von jungen und alten erwachsenen Fliegen sezieren, um sie mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) weiter zu analysieren.
- Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, betäuben Sie ein Fläschchen mit 40 Fliegen mit Kohlendioxid auf einer handelsüblichen Fliegenliege. Verwende dann eine Rasierklinge, um alle Fliegen zu enthaupten und gib sie in eine mit Agarosegel beschichtete Sezierschale. Gießen Sie so viel kaltes PBS plus BSA in die Schüssel, dass die Agarose bedeckt ist. Die Fliegen werden schwimmen.
Greifen Sie dann für jedes Insekt der Reihe nach mit einer Pinzette nach einem fliegenden Bauch und mit einer anderen nach dem Brustkorb. Trenne den Thorax vom Bauch. Der Darm wird sichtbar sein, und der Kropf wird höchstwahrscheinlich noch mit dem Thorax verbunden sein. Greifen Sie nach dem Darm und ziehen Sie ihn aus dem Brustkorb. Greife dann die Gerte und ziehe den Darm leicht nach vorne vom Bauch weg, um ihn zu entfalten.
Fassen Sie dann mit einer der Pinzetten das hintere Ende des Bauches und mit der anderen den Rand der anterior offenen Nagelhaut. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen, und ziehen Sie sehr vorsichtig weiter nach hinten, bis der gesamte Darm aus der Bauchhöhle herausgezogen wurde. Entfernen Sie den Vorderdarm, die Malpighschen Röhren, den Hinterdarm und die Eierstöcke und lassen Sie den nackten Mitteldarm übrig.
Während die Därme isoliert sind, verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um in regelmäßigen Abständen mehrere Darmgewebe gleichzeitig in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das kaltes PBS plus BSA auf Eis enthält.