Präparation des Drosophila-Herzens: eine Technik zur Untersuchung der Herzphysiologie bei der erwachsenen Fliege

- Anders als bei Wirbeltieren ist das Drosophila-Herz Teil eines offenen Kreislaufsystems. Das Herz einer erwachsenen Fliege ist eine röhrenartige Struktur aus Kardiomyozyten, die über die Alary-Muskeln mit der Epidermis verbunden und in eine extrazelluläre Matrix eingebettet ist. Die Herzkammer befindet sich am hinteren Ende der Fliege und pumpt die Hämolymphe in die Aorta, von wo aus sie in die offene Körperhöhle fließt.

Bei Insekten dient die Hämolymphe sowohl als Blut als auch als interstitielle Flüssigkeit und transportiert Nährstoffe, Signalmoleküle und Immunzellen. Weitere Orientierungspunkte des Herzens sind die Ostien, die Öffnungen entlang der Sonde sind, und die intrakardialen Klappen. Perikardzellen sind entlang des Herzschlauchs lokalisiert und Teil des Ausscheidungssystems der Fliege.

In einem experimentellen Herzpräparat ahmt die künstliche Hämolymphe physiologische Bedingungen nach, um die Gewebefunktion zu erhalten. Obwohl die natürliche Hämolymphe nicht für den Gasaustausch verantwortlich ist, muss die künstliche Hämolymphe gut mit Sauerstoff angereichert werden, um das Fehlen eines funktionierenden Trachealsystems zu ersetzen. Im folgenden Experiment demonstrieren wir ein semi-intaktes Herzpräparat von einer adulten Fliege für die Live-Bildgebung oder Elektrophysiologie.

- Bevor es losgeht, bereiten wir zunächst eine künstliche Hämolymphlösung vor. Diese Lösung enthält Saccharose und Trehalose, die der künstlichen Hämolymphe aus gekühlten Stammlösungen kurz vor der Verwendung zugesetzt werden sollten, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Bringen Sie die künstliche Hämolymphe auf Raumtemperatur und versorgen Sie die Lösung mit Sauerstoff, indem Sie sie mindestens 15 Minuten lang an der Luft sprudeln lassen.

Ziehen Sie anschließend mehrere feine Kapillaren mit einem Standard-Pipettenabzieher, der für die Entfernung von Fettkörpern in der Fliege benötigt wird.

Wenn alles vorbereitet ist, müssen erwachsene Fliegen betäubt werden. Dies kann durch kurzes Einwirken der Fliege für zwei bis fünf Minuten erfolgen, aber achten Sie darauf, die Fliegen nicht länger als fünf Minuten im Fliegenschlaf zu lassen. Eine kurzfristige Kälteeinwirkung kann auch zur Betäubung von Fliegen verwendet werden, aber Kohlendioxid wird nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf die Herzfrequenz und den Rhythmus hat.

Als nächstes werden die betäubten Fliegen mit der Rückenseite nach unten in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht Vaseline überzogen ist. Die hydrophobe Nagelhaut an den Flügeln und am Körper sollte reversibel am Gelee haften, die Fliege kann aber bei Bedarf neu positioniert werden. Ein erster Schnitt wird mit einer gebogenen Federschere ausgeführt. Dazu werden die Scherenklingen unter die Beine der Fliege gelegt und in der Nähe des Halses zur dorsalen Oberfläche des Thorax abgewinkelt.

Der Kopf, der ventrale Nervenstrang und die Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Nach dem Schneiden wird das Präparat in die sauerstoffhaltige künstliche Hämolymphlösung getaucht. Mit einer Federschere wird die hintere Spitze des Bauches, die aus den Bauchsegmenten 7 und 8 besteht, mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht seitliche Schnitte entlang beider Bauchkanten und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der Bauchkutikula zu durchtrennen.

Führen Sie die Klingen der Schere in die kleine Öffnung in der Bauchspitze ein und schneiden Sie die Nagelhaut seitlich ein. Dadurch wird ein Rand der ventralen Kutikula frei. Fassen Sie die Klappe mit einer Pinzette und machen Sie einen ähnlichen Schnitt entlang der gegenüberliegenden Seitenkante des Bauches. Der freigelegte Lappen der ventralen Bauchkutikula kann nun entfernt werden.

Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Hilfe einer Juwelierzange und leichtem Ziehen entnommen werden. Bei der Entnahme der inneren Organe kommt der schlagende Herzschlauch zum Vorschein, der noch durch kleine Alarymuskeln mit der dorsalen Nagelhaut verbunden und von Fettkörpern umgeben ist. Die gezogenen Kapillaren werden in einen 1/16-Zoll-Kunststoffschlauch eingeführt, der an einer Vakuumquelle befestigt ist. Die Saugkraft ist proportional zum Spitzendurchmesser, daher sollten keine Pipetten mit Spitzen mit einem Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern verwendet werden.

Einmal eingerichtet, wird dieses Saugsystem verwendet, um überschüssiges Fett aus dem Bereich des Herzschlauchs abzusaugen. Es kann auch verwendet werden, um Luftblasen, die sich um die Nagelhaut ansammeln, und Ablagerungen zu entfernen. Es muss äußerste Vorsicht walten gelassen werden, um zu vermeiden, dass das Herz selbst berührt wird, und da der hintere Teil des Herzens sehr zerbrechlich ist, sollte diese Region ganz vermieden werden. Der adulte Drosophila-Herzschlauch ist jetzt freigelegt und sollte schlagen.

Bei Bedarf können die Nagelhaut und das daran befestigte Herz neu positioniert werden, indem die Nagelhaut vorsichtig aus der Vaseline gehoben und vorsichtig wieder festgedrückt wird, wobei wiederum jeglicher Kontakt mit dem Herzgewebe vermieden wird. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Lösung, in der das Präparat badet, durch frische, künstliche Hämolymphe ersetzt werden. Dieses Präparat sollte vor jeder Manipulation 20 bis 30 Minuten lang mit Sauerstoffzufuhr ausgeglichen werden. Wenn das Präparat länger als 60 Minuten aufrechterhalten werden soll, sollte es erneut mit frischer künstlicher Hämolymphe durchblutet werden. Dieses Präparat ist nun bereit für die optische Aufzeichnung und kann auch für elektrophysiologische Aufzeichnungen oder für histologische Manipulationen verwendet werden.