0 Aufrufe • 2:56 Min. • April 30th, 2023
- Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Verbindung, die auf Toxizität getestet werden soll, und verteilen Sie sie in den Vertiefungen einer Assay-Platte. Übertragen Sie Würmer des entsprechenden Entwicklungsstadiums in jede Vertiefung und starten Sie sofort einen Timer. Notieren Sie sich alle Würmer, die beschädigt sind, und beziehen Sie sie nicht in Ihre Überlebensberechnungen ein.
Zählen Sie nach einer vorgegebenen Zeit die Anzahl der Würmer, die in jeder Vertiefung noch am Leben sind. Das helle Licht eines Präpariermikroskops oder das sanfte Klopfen auf die Platte sollte dazu führen, dass sich lebende Würmer bewegen. Wiederholen Sie diese Beobachtung nach jedem Zeitintervall, bis die meisten Tiere tot sind. Im folgenden Protokoll werden wir die Überlebenszeit von L4-Larven während der Exposition gegenüber Paraquat beobachten, einer Verbindung, die oxidativen Stress induziert.
- In dieser Demonstration wird oxidativer Stress mit Paraquat induziert. Bereiten Sie eine frische 100 millimolare Paraquat-Lösung zu, wie im beigefügten Protokolltext beschrieben. Paraquat ist eine gefährliche und hochgiftige Verbindung und muss gemäß den entsprechenden Richtlinien behandelt werden.
Pipettieren Sie 40 Mikroliter der Paraquatlösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Wells als Replikate aller getesteten Bedingungen. Setzen Sie mit einem Platindraht-Wurmpickel fünf bis acht L4-Larven in jeden Brunnen um.
Geben Sie die Startzeit und die Endzeit für jede getestete Bedingung an. Stellen Sie die 96-Well-Platte auf 20 Grad Celsius. Eine Stunde nach der Startzeit bewerten Sie tote und lebende Tiere mit einem Präpariermikroskop. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie mit dem Zählen beginnen.
Würmer, die sich auch nach dem Erkennen eines hochintensiven Lichts nicht bewegen, werden als tot eingestuft. Schauen Sie sich die Wurmform, den Schwanz und die Kopfbewegung bei hoher Vergrößerung an, um tote Würmer von lebenden Würmern zu unterscheiden. Bewerten Sie stündlich das Überleben, bis die meisten Würmer tot sind, und wiederholen Sie diesen Assay mindestens drei unabhängige Male.
Um den Überlebensprozentsatz für jeden Zeitpunkt zu bestimmen, berechnen Sie zunächst die Gesamtzahl der Tiere pro Zustand, indem Sie die Gesamtzahl der Tiere addieren, die in jede Vertiefung übertragen wurden. Ignorieren Sie die Tiere, die beim Transfer beschädigt oder getötet wurden. Berechnen Sie als Nächstes für jeden Zeitpunkt die Gesamtzahl der toten Tiere pro Zustand. Berechnen Sie den Prozentsatz der Todesfälle und den Prozentsatz der Überlebensrate.