0 Aufrufe • 3:10 Min. • April 30th, 2023
- Beginnen Sie mit pelletierten Eiern, die durch das Bleichen trächtiger adulter Würmer isoliert wurden. Stellen Sie sicher, dass jeder Schritt dieses Verfahrens steril durchgeführt wird, um eine Kontamination der kultivierten Zellen zu vermeiden. Suspendieren Sie das Pellet in einer Chitinase-Lösung, einem Enzym, das Chitin abbaut - ein großes Polysaccharid, das ein struktureller Bestandteil der Eierschale ist.
Nach einer angemessenen Verdauungsphase zentrifugieren Sie die Eier vorsichtig und ersetzen Sie den Überstand durch Zellkulturmedium, um die Verdauung zu stoppen. Führen Sie dann die Embryonen durch eine 18-Gauge-Nadel, um einzelne Zellen mechanisch zu trennen. Als nächstes filterst du die Lösung, um Ablagerungen von der Eierschale oder ungetrennten Zellklumpen zu entfernen. Verteilen Sie die Zellen in einer Kulturschale auf einem gläsernen Deckglas, das mit Erdnussagglutinin beschichtet ist - einem Lektin, das den Zellen hilft, sich an das Deckglas zu binden, indem es Kohlenhydrate an der Zelloberfläche bindet.
Im Beispielprotokoll bereiten wir embryonale Zellen für die in vitro morphologische Differenzierung und Analyse vor.
- Während Sie unter einer Laminar-Flow-Haube arbeiten, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, resuspendieren Sie die pelletierten Eier in einem Milliliter von zwei Milligramm pro Milliliter Chitinase und geben Sie sie in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Schütteln Sie die Tube je nach Frische des Enzyms 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn etwa 80 % der Eierschalen verdaut sind, zentrifugieren Sie die Eier bei 900 g für drei Minuten.
Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entfernt haben, fügen Sie drei Milliliter L15-Medium hinzu. Übertragen Sie die Eier in eine Platte mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern und beginnen Sie mit der manuellen Dissoziation mit einer sterilen 10-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel. Um den Grad der Dissoziation zu überwachen, geben Sie einen Tropfen Suspension in eine frische Petrischale und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop. Fahren Sie fort, bis etwa 80 % der Zellen dissoziiert sind.
Um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpfte Larven zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension vorsichtig durch einen Fünf-Mikron-Filter und lassen Sie weitere vier bis fünf Milliliter L15-Medium durch den Filter laufen, um die Zellen zurückzugewinnen. Um die Zellen nach dem Zentrifugieren des Filtrats bei 900 g für drei Minuten zu kultivieren, werden die Zellen in vollständigem L15-Medium erneut suspendiert. Platten einen Milliliter pro Vertiefung und lagern Sie die Platten in einer feuchten, versiegelten Kammer bei 20 Grad Celsius an der Luft.