C. elegans Chemotaxis-Assay: Eine Methode zum Testen der Chemoempfindung bei Würmern

- Um die vorgefundenen Bedingungen zu verstehen und entsprechend darauf zu reagieren, verfügt der Wurm C. elegans unter anderem über ein hochentwickeltes chemosensorisches System, das in der Lage ist, eine Vielzahl unterschiedlicher Chemikalien zu erkennen.

Sensorische Neuronen im Kopf, die amphidischen und inneren Labialneuronen sowie Neuronen im Schwanz, die phasmidischen Neuronen, sind entweder direkt oder indirekt über die Kutikula den äußeren Bedingungen ausgesetzt. Diese chemosensorischen Neuronen kodieren relevante Informationen, die vom Wurm verwendet werden, um eine angemessene Verhaltensreaktion hervorzurufen: ein Verhalten, das als Chemotaxis bezeichnet wird.

Um die chemotaktische Reaktion auf flüchtige Geruchsstoffe oder geschmackliche wasserlösliche Signale zu testen, isolieren Sie Würmer des gewünschten Entwicklungsstadiums und setzen Sie sie der Testchemikalie auf einer zuvor vorbereiteten Versuchsarena aus. Wenn C. elegans günstigen Chemikalien ausgesetzt ist, wie sie von einer bakteriellen Nahrungsquelle produziert werden, zeigt es eine positive Chemotaxis gegenüber der Quelle.

Umgekehrt zeigt der Wurm, wenn er weniger günstigen oder giftigen Chemikalien wie Schwermetallen ausgesetzt ist, eine negative Chemotaxis und vermeidet die Chemikalie. Daher vermeiden olfaktorische oder gustatorische Mutanten aversive Chemikalien nicht und verharren in ungünstigen Bedingungen, im Gegensatz zu Wildtyp-Tieren, die den aversiven Zustand meiden.

Im Beispielprotokoll sehen wir eine Demonstration eines Chemotaxis-Assays, der die Abneigung des Wurms gegen Kupfer testet.

- Nehmen Sie nach der Inkubation über Nacht die Platten aus dem Inkubator und pipettieren Sie unter Verwendung der markierten Unterseite der Platte 100 Mikroliter frisch zubereitete 0,5-Mol-Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung auf den Rand des Agars, um eine äußere Kupferbarriere zu schaffen. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung, um eine Mittellinienbarriere zu schaffen.

Stellen Sie sicher, dass die Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung nicht mit dem Bakterienpflaster in Berührung kommt, und lassen Sie die Kupferlösung auf der Platte trocknen. Überprüfen Sie alle fünf Minuten nach dem Transfer mit einem Labortuch die Trockenheit, indem Sie die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht abtupfen, um sie zu erkennen.

Unmittelbar vor dem Assay werden die Versuchsorganismen auf eine bakterienfreie Agarplatte umgefüllt und die Nematoden eine Minute lang frei bewegen können, um überschüssige Bakterien zu entfernen.

Als nächstes pipettieren Sie 1 Milliliter M9 auf die Platte mit jungen Erwachsenen, die 24 Stunden zuvor übertragen wurden, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Nematoden eine Minute lang bei 3.000 mal g.

Die Würmer sollten am Boden des Rohres ein Kügelchen bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmkorn zu stören. Geben Sie 1 Milliliter M9-Lösung zum Wurmpellet. Drehen Sie das Rohr um, um die Würmer mit der Lösung zu mischen.

Wenn zunächst überschüssige Bakterien mit den Würmern übertragen wurden, wiederholen Sie dies insgesamt fünfmal. Nach der letzten Wäsche wird der Überstand abgesaugt, bis 100 Mikroliter M9-Lösung übrig bleiben und das Wurmpellet übrig bleibt. Übertragen Sie die Würmer sofort aus der Lösung, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.

Pipettieren Sie 20 Mikroliter des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte. Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden und dass keine kontaminierenden Lebensmittel vorhanden sind. Es sollten keine Bakterien auf die kupfernen Lebensmittelplatten übertragen werden.

Entfernen Sie überschüssige M9-Lösung innerhalb einer Minute mit einem Labortuch aus den Nematoden. Stellen Sie sicher, dass die M9-Lösung nicht mit der Kupfer-Zweisulfatlösung in Kontakt kommt und dass die Würmer und die Agaroberfläche intakt bleiben. Entsorgen Sie Würmer, die versehentlich mit dem Laborgewebe entfernt wurden.

Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer begonnen haben, sich nicht flüssig fortzubewegen, d. h. wenn sie aufgehört haben zu schlagen, starten Sie die Stoppuhr des Assays. Wenn versehentlich zusätzliche Würmer hinzugefügt wurden, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit Halogenkohlenwasserstofföl zupfen, um sicherzustellen, dass keine Bakterien auf die Platte gelangen.

Überprüfen Sie die Assay-Platten alle 30 Minuten. Für die Assay-Platten mit Bakterienpflastern bewerten Sie die Organismen positiv, wenn sie das Lebensmittelpflaster über einen Zeitraum von vier Stunden erreicht haben. Für die negativen Kontrollplatten bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie die Barriere überschritten haben.