C. elegans Bewegungsverfolgung: Eine Methode zur Beurteilung der Fortbewegung bei Würmern

- Um die Fortbewegung bei C. elegans zu beurteilen, verwenden Sie eine Kamera, um die Bewegung der Würmer auf einer Agarplatte aufzuzeichnen, um eine gleichmäßige Ausleuchtung der Platte während der Aufnahme zu gewährleisten. Um die Bewegung der Würmer um die Platte herum einzuschränken, verwenden Sie Kupferringe. Kupfer ist aversiv gegenüber C. elegans, so dass Würmer in den Ringen eingepfercht werden.

Platzieren Sie mehrere Kupferringe auf einer Platte, um gleichzeitig die Würmer in jedem Ring zu verfolgen. Auf diese Weise kann die Beurteilung von Kontroll- und Versuchstieren unter identischen Bedingungen durchgeführt werden, wodurch die Variabilität von Tag zu Tag reduziert und Vergleiche nebeneinander möglich sind. Zeichnen Sie die Bewegung der Würmer über festgelegte Zeitintervalle auf und verwenden Sie Computersoftware, um Merkmale des Verhaltens der Lokomotive zu analysieren, wie z. B. die Geschwindigkeit der Bewegung und die zurückgelegte Strecke.

Im Beispielprotokoll sehen wir eine Demonstration eines Bewegungsverfolgungs-Assays, der die Auswirkungen von Alkohol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit des Wurms testet.

- Nehmen Sie sich zunächst zwei Minuten oder weniger Zeit, um 10 Würmer aus jeder Versuchsgruppe in die Mitte eines Kupferrings auf einer Akklimatisierungsplatte zu übertragen. Dies ist eine Platte ohne Ethanol. Vermeiden Sie es, Futter mit den Würmern zu übertragen, da dies ihre Bewegung verringert. Vermeiden Sie auch eine Beschädigung der Agaroberfläche, da sich die Würmer eingraben. Notieren Sie den Zeitpunkt des Ladens auf die Platte und achten Sie darauf, die Übertragung der Würmer auf jede Platte um mehr als zwei Minuten zu staffeln, damit jede Platte einzeln im richtigen Zeitintervall gefilmt werden kann.

Lassen Sie jede Akklimatisierungsplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie dann die Würmer auf die Testplatte und befolgen Sie die Reihenfolge, in der die Würmer auf der Akklimatisierungsplatte platziert wurden. Sammeln Sie mit einem dünnkantigen, abgeflachten Wurmpickel ohne Bakterien die Würmer auf dem abgeflachten Pickel mit einer Schöpfbewegung. Versiegeln Sie dann die Platte mit Laborfolie, um den Verlust von Ethanol durch Verdampfung zu minimieren.

- Die Geschwindigkeit, mit der die Tiere in diesem Schritt transportiert werden, ist sehr wichtig, da die übertragenen Tiere länger Ethanol ausgesetzt sind. Daher ist es eine gute Idee, die Stämme, die zuerst auf der Platte platziert werden, über experimentelle Replikate zu rotieren.

- Ein Mikroskop mit hochauflösender Videokamera wird nun benötigt, um die Würmer zu filmen. Eine gleichmäßige Beleuchtung, z. B. durch eine drei Zoll große quadratische Hintergrundbeleuchtung, ist für die Analyse von entscheidender Bedeutung. Um den Kontrast beizubehalten, belichten Sie dann die Platte mit der Medienseite nach oben.

Bereiten Sie die Bildanalysesoftware für die Aufnahme von 120-Bild-, 12-Bit-, Graustufen- und Zeitrafferfilmen in einem Bild pro Sekunde vor. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren und gleichzeitig eine ausreichende Bildauflösung beizubehalten, verwenden Sie einen Zwei-mal-Zwei-Binning-Modus.

Nehmen Sie nun zweiminütige Filme von jeder Platte auf, 10 Minuten, nachdem die letzten Würmer auf diese Platte gelegt wurden. Machen Sie dann eine zweite zweiminütige Aufnahme, 30 Minuten, nachdem die Würmer auf die Platte gelegt wurden. Für diese Demonstration wird die Software Image-Pro Plus verwendet, da eine Vielzahl anderer Software an die Technik angepasst werden kann. Analysieren Sie die Filme als Zwei-Minuten-Segmente.

Wenden Sie zunächst einen Filter auf die Bilder an, der den Hintergrund abflacht und den Kontrast der Wurmobjekte erhöht. Wählen Sie im Menü "Verarbeiten", dann "Filter", "Verbesserung" und dann "Reduzieren" aus. Legen Sie den Parameter für einen dunklen Hintergrund und eine Feature-Breite von 20 Pixeln fest.

Analysieren Sie nun die Fortbewegung der Tiere in jedem Ring separat mit einem kreisförmigen Bereich von Interesse, der den Kupferring überlappt. Identifizieren und verfolgen Sie die Würmer mit dem Befehl Objekte verfolgen im Untermenü Messen.

Verwenden Sie im Fenster "Tracking-Datentabelle" die Schaltfläche "Tracking-Optionen", um das Ausschließen bestimmter Spuren zuzulassen und experimentelle Artefakte einzuschränken. Legen Sie auf der Registerkarte "Auto Tracking" die Spurparameter auf eine Geschwindigkeitsbegrenzung von 400 Mikrometern pro Frame fest. Legen Sie das Beschleunigungslimit auf Automatisch fest.

Legen Sie die minimale Gesamtspurlänge auf 400 Mikrometer und den vorherrschenden Bewegungstyp auf Chaotisch fest. Legen Sie dann unter dem Parameter "Spur" die Objekte so fest, dass Teilspuren eine Mindestlänge von 21 Frames und eine Tracking-Projektionstiefe von einem Frame haben.

Um nun den Tracking-Prozess zu starten, klicken Sie zunächst auf die Funktionsschaltfläche Alle Tracks automatisch suchen. Daraufhin werden die Dialogfelder Anzahl-/Größenoptionen und Nachverfolgungsoptionen angezeigt. Wählen Sie die Option Manuell für die Auswahl des Intensitätsbereichs im Dialogfeld Anzahl/Größe. Dies stellt einen wichtigen Schwellenwertschritt dar. Passt dann die Schieberegler für den Intensitätsschwellenwert an, um einen inklusiven Bereich zu erstellen, der dunkle Objekte hervorhebt. Ein guter Ausgangspunkt auf der Skala liegt zwischen 0 und 1.500.

Wenden Sie nun einen Größenfilter an, um Objekte auszuschließen, die größer oder kleiner als ein einzelner Wurm sind. Wechseln Sie zum Menü Messen, und wählen Sie dann das Untermenü Messung aus. Daraufhin wird das Dialogfeld "Anzahl/Größe" geöffnet. Legen Sie dort den Bereichsbereich auf 28.000 bis 120.000 Quadratmikrometer fest. Und stellen Sie den Umfangsbereich auf 600 bis 2.500 Mikrometer ein. Nehmen Sie Anpassungen an diesen Parametern vor, wenn Sie Würmer von abnormaler Größe verwenden.

Schließen Sie nun den Nachverfolgungsvorgang ab, indem Sie im Nachverfolgungsdialogfeld auf Weiter klicken. Vergewissern Sie sich, dass die Ausgabe mit dem Filmmaterial übereinstimmt. Stellen Sie sicher, dass jeder Wurm dargestellt ist, es sei denn, es gibt einen klaren Grund, ihn zu filtern. Löschen Sie dann manuell Spuren, die von Nicht-Wurmobjekten erzeugt wurden.

Berechnen Sie als Nächstes die Geschwindigkeit jedes Wurms, indem Sie den Durchschnitt der zwischen den einzelnen Frames oder jeder Sekunde zurückgelegten Strecke bilden, und erstellen Sie eine durchschnittliche Geschwindigkeit für die Spuren in jeder Population. Betrachten Sie diesen endgültigen Durchschnitt als einen Stichprobenpunkt für die statistische Analyse des Experiments.