Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

- Legen Sie einen transgenen Wurm, der GCaMP exprimiert - ein kalziumempfindliches Protein - zusammen mit bakterieller Nahrung für den Wurm in eine Bildgebungskammer. Anschließend verschließen Sie die Schale mit dem Deckel und der Laborfolie, um ein Verdampfen zu verhindern. Betrachten Sie es unter einem zusammengesetzten Mikroskop, das für Weitfeld-Epifluoreszenz ausgestattet ist. Nehmen Sie Zeitrafferbilder der Würmer auf, um ihr Verhalten zu verfolgen und Fluoreszenz mit Hilfe von Bildgebungssoftware zu erfassen.

Transgene Würmer exprimieren ein GCaMP-Sensorprotein unter der Kontrolle eines Promotors, der die GCaMP-Expression in einem bestimmten Neuron steuert. Wenn dieses Neuron aktiviert wird, feuert es ein Aktionspotential ab, das die Plasmamembran depolarisiert. Bei der Depolarisation öffnen sich spannungsgesteuerte Kalziumkanäle in der Plasmamembran. Dies bewirkt einen Einstrom von Kalziumionen in die Zelle, was zu einer neuronalen Erregung führt.

GCaMP im angeregten Neuron bindet die Kalziumionen. Dies führt dazu, dass GCaMP fluoresziert, wenn die Würmer mit einem Fluoreszenzanregungslicht niedriger Intensität abgebildet werden. Im Beispielprotokoll werden wir Calcium-Imaging verwenden, um die Aktivität von AVA-Interneuronen in transgenen C. elegans in Agarose-Mikrokammern zu visualisieren.

- Die Kalzium-Bildgebung wird an einem Verbindungsmikroskop durchgeführt, das für die Weitfeld-Epifluoreszenz ausgestattet ist. Um die Lichteinwirkung zu begrenzen, verwenden Sie ein Transistor-Transistor-Logiksignal, das eine LED auslöst, um die Probe zu beleuchten, während die Kamera ein Bild aufzeichnet.

Lassen Sie 24 Stunden lang einen Serienfilm laufen, in dem jeder Wurm alle 15 bis 30 Minuten abgebildet wird. Nehmen Sie zuerst 20 Sekunden mit DIC auf, dann 20 Sekunden mit GFP-Fluoreszenz und schließlich ein Bild des mKate2-Signals zur Steuerung der Expressionspegel.

Verwenden Sie für die visuelle Dateninspektion eine Falschfarbenkarte, um die Sichtbarkeit kleiner Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verbessern. Führen Sie schließlich eine Kalziumdatenanalyse mit Standardverfahren durch.