JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 Ansichten • 3:21 Min. • April 30th, 2023
- Übertragen Sie zunächst junge erwachsene Würmer auf ein frisches Agarose-Pad auf einer Folie. Fügen Sie dann ein paar Tropfen 12 millimolare Levamisollösung hinzu, um die Würmer zu lähmen. Decken Sie die Würmer mit einem Deckglas ab und warten Sie einige Minuten. Legen Sie den Objektträger unter ein konfokales Mikroskop mit rotierender Scheibe und fokussieren Sie auf die seitliche äußerste Oberfläche des Wurms.
Die Epidermis eines adulten Wurms ist eine dünne, einschichtige Struktur, die aus mehrkernigen Synzytien besteht, die aus Zellfusionsereignissen resultieren. Die apikale Oberfläche der Epidermis sezerniert eine flexible kollagene Kutikula, während die Basaloberfläche von einer dünnen Schicht extrazellulärer Matrix bedeckt ist, die als basale Lamina bezeichnet wird.
Als nächstes wickeln Sie die apikale Oberfläche der Epidermis mit einem Laser auf. Zytoplasma aus den geschädigten Zellen kann austreten und als Blase an der Wundstelle erscheinen.
Die Laserbestrahlung hat einen Vorteil gegenüber anderen Techniken, wie z. B. der Nadelverletzung, da sie eine lokale Störung der Kutikula und der Epidermiszellen verursacht, ohne das innere Gewebe zu schädigen. Im Beispielprotokoll sehen wir den Prozess der Laserverletzung bei C. elegans.
- Um die Nematoden präzise zu wickeln, wird bei diesem Protokoll ein Femtosekundenlaser verwendet, der an einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop befestigt ist. Auch Linien- oder Punktscans mit Femtosekundenlasern, wie sie in Zwei-Photonen-Mikroskopen zu finden sind, sollten ausreichen.
- Beginnen Sie damit, 10 junge Erwachsene auf einem Agarpad zu sammeln. Lähmen Sie sie in einem zwei Mikroliter Tropfen 12 Millimolar Levamisollösung. Decken Sie sie dann mit einem Deckglas ab und warten Sie einige Minuten, während sie lähmen.
- Es ist wichtig, dass ein Tier vollständig gelähmt ist. 12 Millimolare Levamisol beeinflussen die Wundreaktion nicht. Es können aber auch andere Methoden der Ruhigstellung angewendet werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Femtosekunden-Laserleistung auf 140 Milliwatt eingestellt ist, wie vor dem Objektiv gemessen, und die Laserwiederholrate bei 80 Megahertz liegt. Lokalisieren Sie nun die Würmer unter einem konfokalen Mikroskop mit rotierender Scheibe. Fokussieren Sie sich mit einem 100-fachen Objektiv mit hoher numerischer Apertur auf die laterale anteriore oder hintere synzytiale Epidermis des Zielwurms.
Konzentrieren Sie sich auf die apikale Oberfläche der Epidermiszelle und richten Sie den Laser für bis zu zwei 200-Millisekunden-Pulse im Abstand von 20 Millisekunden an. Dies sollte ausreichen, um die Epidermis zu verwunden. Warten Sie einen Moment und beobachten Sie die lokale Störung des Zytoplasmas, die als Blasenbildung erscheint. Ist ein fluoreszierender Marker vorhanden, kann ein lokalisiertes Bleaching beobachtet werden.