लक्षित लिवर एब्लेशन: ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लार्वा में मेट्रोनिडाजोल के साथ हेपेटोसाइट डेथ को प्रेरित करना

- अंडे के पानी में मेट्रोनिडाजोल को भंग करें जिसमें डीएमएसओ, एक सॉल्वेंट होता है, और फिनाइलथिओरिया डालें, जो भ्रूण में वर्णक गठन को रोकता है। उचित उम्र के कुछ लार्वा को उपचार और नियंत्रण प्लेटों में स्थानांतरित करें। इसके बाद, परीक्षण प्लेट और नियंत्रण प्लेट में डीएमएसओ युक्त अंडे के पानी में मेट्रोनिडाजोल समाधान की वांछित एकाग्रता जोड़ें।

दोनों प्लेटों में लार्वा 28 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि होने दें ट्रांसजेनिक लार्वा केवल हेपेटोसाइट्स में नाइट्रारेक्टेज का उत्पादन करते हैं, जो मेट्रोनिडाजोल को साइटोटॉक्सिक दवा में परिवर्तित कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप केवल लक्षित हेपेटोसाइट्स की मौत हो जाती है । उपचार के बाद, मेट्रोनिडाजोल समाधान को उपचार प्लेट से हटा दें और अंडे के पानी के साथ भ्रूण को धोएं ।

लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के लिए ट्राइकेन जोड़ें और गंभीर हेपेटोसाइट एब्लेशन के लिए एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत उनकी जांच करें - यकृत कोशिकाओं का विनाश। आप नियंत्रण समूह के व्यक्तियों की तुलना में इलाज किए गए व्यक्तियों में बहुत छोटे जिगर का निरीक्षण करेंगे। उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा में हेपेटोसिटे एब्लेशन के लिए मेट्रोनिडाजोल का उपयोग करेंगे।

- 100 भ्रूण को 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 25 मिलीलीटर अंडे का पानी होता है और डिश को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पिगमेंटेशन को रोकने के लिए, निषेचन के बाद 10 घंटे तक संस्कृति में पीटीयू जोड़ें। निषेचन के बाद 80 घंटे में, लार्वा को ट्राइकेन के साथ एनेस्थेटाइज करें और सीएफपी सकारात्मक लार्वा को इकट्ठा करने के लिए एक एप्फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, केवल इसी तरह के आकार के यकृत वाले जानवरों को रखते हुए

इसके बाद ट्राइकेन अंडे के पानी को पीटीयू के साथ सप्लीमेंट कर के ताजे अंडे के पानी से बदल दें और सीएफपी पॉजिटिव जेब्राफिश लार्वा को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस कर दें । जेब्राफिश लार्वा को एमटीजेड के साथ इलाज के लिए सबसे पहले, उपयुक्त संख्या में लार्वा को दो अलग-अलग संस्कृति जहाजों में विभाजित करें। प्रयोगात्मक लार्वा समूह को नए सिरे से तैयार एमजेड और नियंत्रण समूह के घोल में रखें डीएमएसओ के साथ पूरक।

आवरण के प्रयोगात्मक समूह साथ एल्यूमीनियम पन्नी करने के लिए रोकना फोटो निष्क्रियता के के एमजेड और इनक्यूबेट दोनों समूहों के जेब्राफिश लार्वा पर 28 डिग्री सेल्सियस। पर के अंत के के अपक्षरण अवधि निकालें के एमजेड विलयन से के प्लेटें और धोना के MTZ-इलाज लावड़े दो करने के लिए तीन बार साथ 25 मिलीलीटर के अंडे का पानी और घूमता त्यागना के अंडा पानी बाद प्रत्येक धोना। बाद के पिछला धोना स्थिर के लार्वा साथ आधा के एकाग्रता के ट्राइकेन पहले इस्तेमाल किया करने के लिए बचना दिल सूजन और अवसान में के MTZ-इलाज लार्वा। फिर उपयोग के सीएफपी फ़िल्टर पर एक एपिफ्लोरेसेंस सूक्ष्‍मदर्शी करने के लिए मूल्‍यांकन करना के हेपेटोसिट अपक्षरण स्तर आधारित पर के सापेक्ष कलेजी आकार वाला के के MTZ-इलाज लावे। विचार करना के जेब्राफिश साथ बड़ा यकृत प्रतिनिधित्व 0% करने के लिए 5% के के लार्वा करने के लिए होना अप्रतिम, उन साथ मध्यम आकार यकृत प्रतिनिधित्व 10% करने के लिए 20% के के लार्वा करने के लिए होना आंशिक अप्रकाशित, और उन साथ बहुत मामूली यकृत प्रतिनिधित्व 80% करने के लिए 90% के के लार्वा करने के लिए होना यथासंभव अधिकतम ablated।