Overview
लेख में लक्षित यकृत एब्लेशन का वर्णन किया गया है, जो ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लार्वा में मेट्रोनिडाजोल के साथ हेपेटोसिटे मौत को प्रेरित करने के लिए एक विधि है। नमूना प्रोटोकॉल जेब्राफिश में लक्षित यकृत एब्लेशन को उत्पन्न करने, हेरफेर करने और मूल्यांकन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Protocol
1. भ्रूण/लार्वा की तैयारी
- 100 भ्रूण को 25 मिलीलीटर अंडे के पानी के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पेट्री डिश प्रति 100 से अधिक भ्रूण रखें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर उठाएं।
- पिगमेंटेशन को बाधित करने के लिए, 10 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) से पहले पेट्री व्यंजनों में फिनाइलथोरिया (पीटीयू) जोड़ें, और 80 एचपीएफ तक भ्रूण/लार्वा उठाएं। पीटीयू की अंतिम एकाग्रता 0.2 mM है।
सावधानी-पीटीयू विषाक्त है। उचित हैंडलिंग दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग करें। - पेट्री व्यंजनों में 0.016% की अंतिम एकाग्रता पर 3-अमीनो बेंजोइक एसिड एथिल एस्टर (ट्राइकेन) जोड़कर लार्वा को एनेस्थेटाइज करें। फिर, एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सीएफपी-पॉजिटिव लार्वा को सॉर्ट करें। एक समान जिगर के आकार के साथ लार्वा का उपयोग करें और एक छोटे या बड़े जिगर के साथ उन त्यागें।
नोट:किसी भी सीएफपी-सकारात्मक लार्वा, तीव्रता की परवाह किए बिना, उपयोग किया जा सकता है क्योंकि हेमिज़िगस और होमोज़िगस लार्वा के बीच हेपेटोसिट एब्लेशन की सीमा में कोई अंतर नहीं है।
सावधानी:ट्राइकेन विषाक्त है। उचित हैंडलिंग दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग करें। - ट्राइकेन युक्त अंडे के पानी को निकालें और 0.2 m m PTU के साथ पूरक अंडे का पानी जोड़ें। भ्रूण/लार्वा को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
2. एमजेड उपचार
- 0.2% DMSO और 0.2 m M PTU के साथ पूरक 100 मिली अंडा पानी में Mtz पाउडर के 0.171 ग्राम भंग करके ताजा 10 mM Mtz समाधान तैयार करें। एमट्ज को पूरी तरह से भंग करने के लिए, 20-30 मिनट के लिए तेजी से सरगर्मी के साथ आरटी में समाधान मिलाएं। एमटीजेड को घुलनशील बनाने में मदद करने और लार्वा में एमजेड परमीशन को बढ़ाने के लिए, एमएमटीजेड तैयार करते समय डीएमएसओ जोड़ें।
सावधानी:लंबे समय तक एक्सपोजर या एमजेड की बढ़ी हुई एकाग्रता विषाक्त है। उचित हैंडलिंग दिशानिर्देशों के अनुसार उपयोग करें। - लार्वा की वांछित संख्या को दो अलग-अलग 100 मिमी पेट्री डिश या मल्टी-वेल प्लेट में स्थानांतरित करके लार्वा को नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में अलग करें। प्रायोगिक समूह के लिए, लार्वा को 10 एमएम एम्टजेड समाधान में रखें; नियंत्रण समूह के लिए, उन्हें अंडे के पानी में रखें जिसमें 0.2% डीएमएसओ हो।
- एमटीजेड की फोटो-निष्क्रियता को रोकने और 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए एल्यूमीनियम फॉयल के साथ एमट्ज समाधान युक्त प्लेटों या पेट्री व्यंजनों को कवर करें। एमटीजेड उपचार की अवधि लार्वा चरण और ट्रांसजेनिक लाइन पर निर्भर करती है।
3. पित्त चालित जिगर उत्थान का विश्लेषण
- एब्लेशन अवधि के अंत में, प्लेटों से एमजेड समाधान निकालें। एमटीजेड-उपचारित लार्वा को 25 मिलीलीटर अंडे का पानी डालकर धोएं। अंडे के पानी को छोड़ने से पहले लार्वा को धोने के लिए प्लेट को 2-3 बार चक्कर लगाते हैं। तीन बार दोहराएं और फिर लार्वा को एक बार और अंडे के पानी में विसर्जित करें। एमजेड-इलाज लार्वा में दिल के एडीमा और लार्वा की मौत से बचने के लिए, लार्वा को स्थिर करने के लिए 0.008% की अंतिम एकाग्रता पर ट्राइकेन की कम एकाग्रता जोड़ें।
- जिगर विश्लेषण के लिए, सीएफपी फिल्टर के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत एमजेड-उपचारित लार्वा के यकृत आकार की जांच करें। सापेक्ष यकृत आकार के आधार पर हेपेटोसाइट एब्लेशन स्तरों का आकलन करें: बड़े (गैर-एब्लेटेड; 0-10% लार्वा), मध्यम (आंशिक रूप से ablated; 10-20%), और बहुत छोटा (पूरी तरह से ablated; 80-90%)
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA |
