Gezielte Leberablation: Induktion des Hepatozytentods mit Metronidazol bei transgenen Zebrafischlarven

- Lösen Sie Metronidazol in Eiwasser auf, das das Lösungsmittel DMSO enthält, und fügen Sie Phenylthioharnstoff hinzu, das die Pigmentbildung in Embryonen verhindert. Übertragen Sie einige Larven des entsprechenden Alters auf Behandlungs- und Kontrollplatten. Geben Sie anschließend die gewünschte Konzentration der Metronidazollösung auf die Testplatte und Eiwasser, das DMSO enthält, auf die Kontrollplatte.

Lassen Sie die Larven in beiden Platten bei 28 Grad Celsius wachsen. Die transgenen Larven produzieren Nitroreduktase nur in Hepatozyten, die das Metronidazol in ein zytotoxisches Medikament umwandelt, was zum Tod nur der Zielhepatozyten führt. Nehmen Sie nach der Behandlung die Metronidazollösung von der Behandlungsplatte und waschen Sie die Embryonen mit Eiwasser.

Fügen Sie Tricain hinzu, um die Larven zu betäuben, und untersuchen Sie sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop auf schwere Hepatozytenablation - die Zerstörung von Leberzellen. Sie werden bei behandelten Personen eine viel kleinere Leber beobachten als bei Personen der Kontrollgruppe. Im Beispielprotokoll werden wir Metronidazol für die Hepatozytenablation in transgenen Zebrafischlarven verwenden, um die Leberregeneration zu untersuchen.

- Geben Sie bis zu 100 Embryonen in eine 100 Millimeter große Petrischale, die 25 Milliliter Eiwasser enthält, und stellen Sie die Schale auf 28 Grad Celsius. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie der Kultur bis zu 10 Stunden nach der Befruchtung PTU hinzu. 80 Stunden nach der Befruchtung betäuben Sie die Larven mit Tricain und verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um die CFP-positiven Larven zu sammeln, wobei nur die Tiere mit ähnlich großen Lebern behalten

Ersetzen Sie dann das Tricain-Eiwasser durch frisches Eiwasser, das mit PTU ergänzt ist, und geben Sie die CFP-positiven Zebrafischlarven wieder in den 28 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Um die Zebrafischlarven mit MTZ zu behandeln, wird zunächst die entsprechende Anzahl an Larven auf zwei verschiedene Kulturgefäße aufgeteilt. Halten Sie die Versuchslarvengruppe in einer Lösung aus frisch zubereitetem MTZ und die Kontrollgruppe in Eiwasser, das mit DMSO versetzt wurde.

Decken Sie die Versuchsgruppe mit Alufolie ab, um eine Photoinaktivierung der MTZ zu verhindern, und inkubieren Sie beide Gruppen von Zebrafischlarven bei 28 Grad Celsius. Am Ende der Ablationsphase nehmen Sie die MTZ-Lösung von den Platten und waschen Sie die mit MTZ behandelte Lava zwei- bis dreimal mit 25 Millilitern Eiwasser und schwenken Sie, wobei Sie das Eiwasser nach jedem Waschen entsorgen. Nach der letzten Wäsche immobilisieren Sie die Larven mit der Hälfte der zuvor verwendeten Tricainkonzentration, um Herzödeme und Tod bei den MTZ-behandelten Larven zu vermeiden. Verwenden Sie dann den CFP-Filter an einem Epifluoreszenzmikroskop, um die Hepatozytenablationswerte basierend auf der relativen Lebergröße der MTZ-behandelten Lava zu beurteilen. Betrachten Sie Zebrafische mit großen Lebern, die 0 % bis 5 % der Larven ausmachen, als nicht abtragend, Zebrafische mit mittelgroßer Leber, die 10 % bis 20 % der Larven ausmachen, die teilweise abgetragen werden sollen, und Zebrafische mit sehr kleiner Leber, die 80 % bis 90 % der Larven ausmachen, die vollständig abgetragen werden sollen.