Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Nehmen Sie zunächst eine angemessene Konzentration geschmolzener Agarose in ein konisches Röhrchen und fügen Sie eine gewünschte Menge warmes Kulturmedium hinzu. Vorsichtig umkehren, um den Inhalt zu vermischen. Geben Sie diese Mischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und lassen Sie sie fest werden. Dies ist die unterste Schicht. Behandeln Sie anschließend Krebszellen mit der interessierenden Verbindung und fügen Sie die erforderliche Konzentration an Agarose hinzu.

Gießen Sie nun diese Mischung mit der gewünschten Anzahl von Zellen pro Milliliter in jede Vertiefung. Dabei handelt es sich um eine zellhaltige Schicht. Sobald das Medium fest geworden ist, inkubieren Sie die Platte eine Woche lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Feederschicht vor, indem Sie Agarose mit dem Medium mischen und diese Mischung mit der interessierenden Verbindung ergänzen. Geben Sie diese Feeder-Schicht vorsichtig in jede Vertiefung, lassen Sie sie erstarren und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius.

Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, um die Zellen mit dem Medium aufzufüllen, bis sich Kolonien bilden. Wenn die interessierende Verbindung ein Inhibitor der Tumorigenität ist, unterdrückt sie das Zellwachstum, was zu wenigen Kolonien in den Vertiefungen führt. Im folgenden Protokoll werden wir einen Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien durchführen, um die Wirkung von PADI-Inhibitoren auf die Tumorigenität von Brustkrebszellen zu untersuchen.

Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Zubereitung von 3% 2-Hydroxyethyl-Agarose. In eine saubere, trockene 100-Milliliter-Glasflasche werden 0,9 Gramm 2-Hydroxyethyl-Agarose und anschließend 30 Milliliter destilliertes Wasser gegeben. Die Mischung 15 Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen und vorsichtig schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis sich das Agarosepulver vollständig aufgelöst hat. Als nächstes autoklavieren Sie die Lösung mit der Flasche für 15 Minuten.

Lassen Sie die Agaroselösung vor der weiteren Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen. Erwärmen Sie mehrere Fünf-Milliliter- und 10-Milliliter-Pipetten in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um zu verhindern, dass sich die Agarose beim Hantieren in der Pipette verfestigt. Lösen Sie den Flaschendeckel teilweise und erhitzen Sie die vorgefertigte 3%ige 2-Hydroxyethyl-Agarose-Lösung 15 Sekunden lang in der Mikrowelle. Dann die Lösung vorsichtig schwenken und weitere 15 Sekunden in die Mikrowelle stellen.

Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Agaroselösung schwenken, da die Lösung an der Luft aufsteigt und überschwappen kann. Wenn sich Reste von festem Gel in der Flasche befinden, noch einige Sekunden in der Mikrowelle erhitzen. Bewahren Sie die Flasche mit der Agaroselösung während der nächsten Schritte in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, um ein vorzeitiges Erstarren der Agaroselösung zu verhindern.

Übertragen Sie anschließend 12 Milliliter erwärmtes Medium mit den vorgewärmten Pipetten in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Sofort drei Milliliter der 3%igen Agaroselösung zugeben und das konische Röhrchen vorsichtig umdrehen, um die Agarose mit dem Medium zu vermischen. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter dieser Mischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte, ohne Luftblasen zu bilden. Inkubieren Sie die Sechs-Well-Kulturplatte eine Stunde lang horizontal auf einer ebenen Fläche bei vier Grad Celsius, damit sich die Mischung verfestigen kann.

Nachdem die Mischung fest geworden ist, stellen Sie die Platte für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Die untere Schicht ist nun einsatzbereit.

Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass alle Zellen gleichmäßig verteilt sind und dass sich das geschmolzene Agarosegel vor der Zugabe zu jeder Vertiefung nicht verfestigt, um sicherzustellen, dass die Zellen vor der Zugabe des flüssigen Agarosegels in das Medium gemischt werden. Zusätzlich werden die Pipetten vorher vorgewärmt, um zu verhindern, dass sich die Lösungen während der Handhabung verfestigen.

Um die zellhaltige Schicht herzustellen, trypsinisieren Sie zunächst MCF10DCIS Zellen und verdünnen sie auf eine Zellkonzentration von 40.000 Zellen pro Milliliter. Nehmen Sie dann acht Milliliter des Mediums mit vorgewärmten Pipetten und geben Sie es in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie sofort zwei Milliliter 3% Agarose in das konische Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um die Agarose mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

Als nächstes nehmen Sie zwei Milliliter der Zellen und behandeln sie mit zwei mikromolaren BB-Chloramidin in DMSO oder DMSO allein als Kontrolle. Nach der Behandlung mischen Sie die Zellen mit einer 0,6%igen Agarose in einer Eins-zu-Eins-Verdünnung, um eine Endkonzentration von einem mikromolaren BB-Chloramidin zu erreichen. Nehmen Sie dann einen Milliliter des Zell-Agarose-Gemisches und geben Sie es vorsichtig auf die untere Schicht der Sechs-Well-Kulturplatte.

Legen Sie die Sechs-Well-Kulturplatte mindestens 15 Minuten lang horizontal bei vier Grad Celsius auf eine ebene Fläche, damit sich die oberste Schicht verfestigen kann. Nachdem die Mischung fest geworden ist, legen Sie die Platte für eine Woche in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bevor Sie die Futterschicht hinzufügen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Fütterungsschicht, indem Sie die vorgefertigte 3%ige 2-Hydroxyethyl-Agaroselösung wie zuvor in der Mikrowelle erhitzen und die Flasche der Agaroselösung in einem 45 Grad Celsius warmen Wasserbad äquilibrieren.

Mischen Sie einen Milliliter 3%ige Agaroselösung mit neun Millilitern warmem Medium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um die Agarose mit dem Medium zu vermischen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Nach der Behandlung der Mischung mit BB-Chloramidin geben Sie vorsichtig einen Milliliter der Mischung in jede Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte, die die untere und die weiche Schicht enthält. Stellen Sie dann die Sechs-Well-Kulturplatte für mindestens 15 Minuten horizontal bei vier Grad Celsius auf eine ebene Fläche, damit sich die Mischung verfestigen kann.

Nachdem sich die Feederschicht verfestigt hat, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Wiederholen Sie diesen Fütterungsvorgang wöchentlich, indem Sie einen Milliliter 0,3%ige Agarose-Medium-Behandlungslösung auf die vorhandene Feeder-Schicht auffüllen, um die Zellen mit neuen Medien aufzufüllen, bis die Koloniebildung beobachtet wird.