Niederfrequente Ultraschallanwendung: Eine Methode zur Bestimmung der Wirkung von Ultraschall auf menschliche Leukämiezellen

- Zu Beginn säen Sie die menschlichen Leukämiezellen in einem frisch vorbereiteten Nährmedium aus und inkubieren Sie sie für den gewünschten Zeitraum. Nach der Inkubation färben Sie eine kleine Menge dieser Zellsuspension mit Trypanblau und beurteilen Sie die Zellviabilität mit einem TC20-Zellzähler. Tote Zellen sind durchlässig und nehmen den negativ geladenen Farbstoff auf, während lebensfähige Zellen undurchlässig sind.

Als nächstes fügen Sie dem Kulturkolben Methyl-Beta-Cyclodextrin hinzu, um das Cholesterin der Zelle ausreichend zu erschöpfen und sie anfällig für Ultraschall zu machen. Inkubieren Sie die Zellen für den gewünschten Zeitraum. Füllen Sie das Zellbeschallungssystem mit deionisiertem Wasser und entgasen Sie es einige Minuten lang, um Vakuumblasen zu vermeiden. Übertragen Sie die gewünschte Menge an Zellen in das Szintillationsfläschchen und befestigen Sie das Fläschchen an der Haltevorrichtung des Zellbeschallungssystems.

Setzen Sie die Haltevorrichtung auf das Horn und stellen Sie die gewünschte Höhe von der Spitze des Horns ein. Stellen Sie die erforderlichen Impulse für die gewünschte Dauer ein, um die Zellen zu beschallen. Geben Sie Trypanblau in die Zellsuspension und legen Sie es in den TC20-Zellzähler, um die Lebensfähigkeit und Schädigung der Zellen zu analysieren. Mit Methyl-Beta-Cyclodextrin behandelte Leukämiezellen zeigen, wenn sie niederfrequentem Ultraschall ausgesetzt sind, eine signifikante Zelllyse.

Im folgenden Protokoll werden wir die Zellbeschallung und die Schadensbewertung von humanen Leukämiezellen untersuchen.

- Um die Zellen für die Beschallung vorzubereiten, säen Sie sie zunächst in einem 25 Quadratzentimeter großen Kolben mit frisch zubereitetem Medium in 4 mal 10 bis vier Zellen pro Milliliter aus. Nachdem die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt wurde, wird die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert, bis die Kultur die gewünschte Konzentration erreicht hat. Wenn die Zellen für die Beschallung bereit sind, wird ein Volumen ionisiertes destilliertes Wasser mit einem Vakuum und einem Buchnerkolben entgast. Füllen Sie dann mit dem Wasser das Becherhorn bis zu 15 Millimeter über der Oberseite des Horns.

Lassen Sie das System etwa sieben Minuten lang mit dem entgasten Wasser laufen, geben Sie dann 3 Milliliter Zellen in ein 20-Milliliter-Szintillationsglasfläschchen und befestigen Sie das Fläschchen an der Haltevorrichtung. Befestigen Sie als Nächstes die Haltevorrichtung an der Oberseite des Becherhorns und stellen Sie die Haltevorrichtung mit dem Schiebemechanismus auf eine Höhe von 15 Millimetern von der Oberseite des Horns an der Wasseroberfläche ein. Beschallen Sie nun die Zellen mit drei einsekündigen Ultraschallimpulsen mit einem Abstand von einer Sekunde zwischen jedem der Impulse bei einer Amplitude von 33 % und 50 %.

Beurteilung der Zellviabilität nach Beschallung durch Trypanblau-Ausschluss. Um die Zellschädigung zu beurteilen, spülen Sie die Öffnung eines Z2-Partikelanalysators mindestens 2 Mal mit isotonischer Kochsalzlösung. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der beschallten Zellen in 20 Milliliter isotonische Kochsalzlösung und überführen Sie die Zellprobe in den Gegenhalter. Heben Sie dann die Plattform bis zur Öffnung an und analysieren Sie den Zellschaden, die Lebensfähigkeit und den Schmutz gemäß den Anweisungen des Herstellers.