XTT Assay: Ein kolorimetrischer Assay zur Beurteilung der Zellviabilität und der mitochondrialen Aktivität

- Niederfrequente Ultraschallwellen führen zur selektiven Lyse menschlicher Leukämiezellen und der XTT-Assay hilft bei der Bestimmung des Ausmaßes dieser Schädigung. Der Assay funktioniert nach dem Prinzip, dass die mitochondrialen Enzyme gesunder Zellen einen gelben XTT-Farbstoff in eine orangefarbene Verbindung namens Formazan umwandeln. Zu Beginn des Assays behandeln Sie die Zellen mit Methyl-Beta-Cyclodextrin, einem cholesterinabbauenden Mittel, und beschallen Sie die Zellen anschließend mit geringer Leistung, um Zellschäden zu induzieren.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren, und fügen Sie dem Pellet frisches Zellwachstumsmedium hinzu. Säen Sie die Zellen in der gewünschten Konzentration in eine Multi-Well-Mikroplatte und inkubieren Sie sie über Nacht. Geben Sie nun die aktivierte XTT-Lösung in die Zellen und inkubieren Sie, bis sich die orange Farbe in den Vertiefungen der Mikroplatte entwickelt. Legen Sie die Platte in ein Spektralphotometer. Messen Sie die Extinktion bei 450 bis 500 Nanometern und dann bei 630 bis 690 Nanometern. Subtrahieren Sie die beiden Werte, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Der höhere Wert der Absorption im XTT-Assay deutet auf eine höhere Aktivität der mitochondrialen Enzyme und eine höhere Zellviabilität hin.

Im folgenden Video demonstrieren wir die Verwendung des XTT-Assays zur Bestimmung der Wirksamkeit von niederfrequenten Ultraschallwellen, um Zellschäden in mit Methyl-Beta-Cyclodextrin behandelten Leukämiezellen zu verursachen.

- Um die Lebensfähigkeit von beschallten Zellen durch den XTT-Assay zu beurteilen, beschallen Sie die Zellen mit einem Bereich von ein bis drei einsekündigen Impulsen, die auf einem Abstand von einer Sekunde basieren, um einen Schadensbereich zu entwickeln, den das XTT-Kit beurteilen kann. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie die Pellets wieder auf 1 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in frisch zubereitetem Wachstumsmedium. Als nächstes säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in einzelne 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden in dreifacher Ausfertigung, einschließlich drei Kontrollvertiefungen, die allein 100 Mikroliter des vollständigen Wachstumsmediums für blinde Absorptionsmessungen enthalten. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.

Am Morgen des Assays werden die Aliquots des bei 37 Grad Celsius erwärmten XTT und der Aktivierungsreagenzien vorsichtig geschwenkt, bis die Lösungen klar sind. Fügen Sie dann 0,1 Milliliter des Aktivierungsreagenzes zu einem 5 Milliliter Aliquot des XTT-Reagenzes hinzu. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der aktivierten XTT-Lösung in jede Vertiefung der mit U937 und THP1 beimpften Platten und geben Sie die Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator. Schütteln Sie die Platten nach zwei Stunden vorsichtig, um den orangefarbenen Farbstoff gleichmäßig in den positiven Vertiefungen zu verteilen, und messen Sie die Absorption auf einem Mikrotiterplatten-Reader zwischen 450 und 500 Nanometern. Messen Sie abschließend die Absorption aller Assay-Wells erneut zwischen 630 und 690 Nanometern.